Préférence de séquence d’ADN et orientation additive des agents antitumoraux de la pyrrolo [2,1-c] [1,4] benzodiazépine

Le pyrrolo [2,1-c] [1 , 4] benzodiazepines (PBDs) sont une classe bien connue des agents interactifs d’ADN de liaison-covalents sélectifs de séquence1 & 4 qui s’adaptent parfaitement dans la rainure mineure d’ADN en raison de leur position C11a (S) chirale, qui fournit une torsion longitudinale droite isohelical avec l’ADN double brin.3 Ils possèdent également un groupement d’imine N10 électrophile (ou l’équivalent de carbinolamine ou de carbinolamine méthyl éther) qui peut former une liaison aminale covalente entre leur position C11 et la Le groupe C2-NH2 nucléophile d’une base guanine.3 Les PBD monomères simples tels que les produits naturels anthramycine (Figure 1) et la tomaymycine couvrent généralement trois paires de bases d’ADN. Il existe de nombreux rapports dans la littérature basés sur la RMN, 5 la cristallographie aux rayons X, 6 la modélisation moléculaire, 7 et les expériences à base de gel (par exemple, l’empreinte de l’ADN8 et les tests d’arrêt de polymérase in vitro9) suggérant un ordre de préférence. à 5 ′ -Pu-G-Pu-3 ′ > Pu-G-Py ∼ Py-G-Pu > Séquences Py-G-Py avec les adduits orientés de telle sorte que la bague PBD A pointe vers le 3 ′ terminus du brin modifié par covalence. Il a été démontré que les PBD induisent un certain nombre d’effets biologiques, notamment l’inhibition de l’endonucléase10 et de l’ARN polymérase9, et l’inhibition de la liaison du facteur de transcription NF. PBD C8 conjugué bis-pyrrole 2 (GWL-78) .La liaison covalente des PBD à l’ADN est présumée être un processus en deux étapes, 11 la première impliquant la reconnaissance d’un site de liaison à basse énergie favorisé par une association non covalente réversible rapide du médicament dans la rainure mineure par des interactions comprenant la liaison hydrogène, van der Waals et des contacts électrostatiques. Si ces interactions intermoléculaires non covalentes sont faibles, la molécule se dissocie probablement puis se réassocie à un autre site, le processus se répétant jusqu’à ce que le PBD trouve un triplet de basse énergie approprié avec le C2-NH2 d’une guanine centrale alignée pour l’attaque nucléophile au PBD. C11-position. La deuxième étape devrait alors se produire, avec une formation de liaison covalente entre la guanine et le PBD, à quel point la molécule sera bloquée en position bronchite chronique. La vitesse de cette seconde étape covalente est beaucoup plus lente que l’association non covalente initiale et peut, selon la littérature, prendre jusqu’à 24 h pour être complète. GWL-7811 (2, figure ​ Figure 1) 1) est un PBD- Conjugué C8-dipyrrole conçu pour couvrir cinq paires de bases d’ADN avec deux paires de bases AT (reconnues par les cycles bis-pyrrole) adjacentes à un site de liaison de triplet PBD. Il a été démontré qu’il pénètre avec succès dans les membranes cellulaires et nucléaires pour atteindre le noyau où il interagit de manière covalente avec l’ADN et interfère avec la progression du cycle cellulaire.12,13 Plus spécifiquement, il a été démontré que 2 inhibe la liaison du NF Υ facteur de transcription à ses séquences apparentées (par exemple, CCAAT) dans la topoisomérase II α région promoteur, provoquant ainsi une diminution de topo II α expression et blocage de la progression du cycle cellulaire, conduisant finalement à l’apoptose.12Un test de chromatographie liquide / spectrométrie de masse (HPLC / MS) haute performance développé dans notre laboratoire14 a été utilisé pour étudier la réaction de 2 avec un ensemble de huit épingles oligonucléotides (tableau 1) pour établir à la fois la vitesse d’alkylation et l’orientation de la molécule de PBD dans les adduits formés. Chaque oligonucléotide contenait un seul triplet de liaison à la PBD à l’un de deux emplacements différents, les triplets contenant toutes les combinaisons possibles de X-G-X, où X était A ou T.L’utilisation de G ou C (pour X) a été évitée pour limiter le nombre de sites possibles d’interaction covalente à un par oligonucléotide. Les triplets X-G-X ont été positionnés dans l’un des deux emplacements possibles pour permettre l’étude de l’orientation de liaison de la molécule de PBD. Dans les quatre premiers oligonucléotides (Seq-1 à Seq-4, tableau 1), le site de liaison de PBD était situé immédiatement à côté de l’extrémité 5 ′ -end de la boucle TTT centrale. Les séquences en épingle à cheveux, qui n’ont aucune pertinence biologique directe, ont été conçues pour avoir une longueur suffisante (c.-à-d. 17-mer) pour assurer la formation d’un petit sillon dans la structure en épingle, comme nous l’avons déjà montré. de sept paires de bases sont nécessaires pour fournir un environnement de rainure mineur suffisant pour la fixation covalente d’un PBD. Les séquences 17-mères étaient donc la longueur minimale possible représentant la région de la boucle TTT à trois bases et sept paires de bases sur chaque bras de l’épingle à cheveux. Pour ces oligonucléotides, on s’attendait à ce que 2 se lie avec son composant C8-bis-pyrrole orienté vers l’extrémité 5 ‘de l’oligonucléotide de sorte que les unités pyrroles puissent être logées dans l’environnement de rainure mineure de la région de tige (Figure &#x200B (figure 2A) .2A). Dans ce cas, l’orientation inverse serait improbable car, selon des études de modélisation moléculaire, le composant bis-pyrrole devrait faire saillie à travers le − TTT − boucle de l’épingle entraînant des collisions stériques importantes. Dans le second ensemble de quatre oligonucléotides (Seq-5 à Seq-8, Tableau 1), le site de liaison a été positionné au point 5 ′ terminus de la région de la tige dans lequel cas 2 devrait s’orienter avec son anneau A vers l’extrémité 3 ′ -fin que, une fois de plus, les unités pyrroles puissent être logées dans l’environnement de la rainure mineure de la tige (Fig. Figure2B) .2B). Dans ce cas, l’orientation opposée était également considérée comme improbable, car le composant bis-pyrrole devait alors dépasser au-delà de l’extrémité en épingle à cheveux avec une perte d’interactions stabilisant l’ADN / ligand et la possibilité que les forces de solvatation déstabiliser l’adduct.Figure 2 Diagrammes schématiques montrant les orientations les plus probables de 2 après liaison covalente aux deux différents groupes d’oligonucléotides. (A) Pour Seq-1 à Seq-4, 2 est susceptible de s’orienter avec son anneau A dans la direction 5 ′ avec une liaison hydrogène formant … Constantes Tableau 1Rate (μ M / min) et Modifications de l’énergie libre (Δ G) pour la réaction covalente du bisphénol PBD C8-conjugué 2 (GWL-78) avec les oligonucléotides isomères Seq-1 à Seq-8aInteraction de 2 avec les oligonucléotides Seq-1 à Seq-8 a été étudié en utilisant un dosage HPLC et les adduits 2 / oligonucléotides ont été identifiés par spectrométrie de masse à temps de vol à désorption / ionisation assistée par matrice (MALDI TOF-MS). Les huit oligonucléotides sont tous isomères avec une masse théorique de 5173,49 chacun. La liaison covalente d’une molécule de 2 à n’importe quel oligonucléotide devrait augmenter la masse à une valeur théorique de 5764,12. Des valeurs allant de 5761,63 à 5787,90 ont été observées pour les huit adduits formés, tous dans la marge d’erreur expérimentale. Des études antérieures ont montré que seuls les adduits covalents fournissent des signaux MALDI TOF, car les adduits non covalents ne survivent pas aux conditions d’un spectromètre de masse16. Seq-1 anormal a donné un seul pic à la température de 26,0 min, qui a été collecté et identifié par MALDI-TOF- MS (figure ​ (figure 3A) .3A). La préincubation de Seq-1 avec 2 pendant 30 min à température ambiante suivie d’une injection immédiate sur la colonne HPLC a conduit à l’apparition rapide d’un nouveau pic à RT 27,0 min (Figure 3B) avec disparition presque complète de Seq-1 de 60 min (figure ​ (figure 3C) .3C). Le pic d’adduit (RT 27,0 min) a été recueilli et identifié par MALDI-TOF-MS en tant qu’adduit covalent 1: 1 2 / Seq-1 (voir les informations de support). Une expérience de temps a été réalisée en mesurant l’aire décroissante sous la courbe (ASC) pour le pic Seq-1 à divers moments (jusqu’à 60 minutes) en utilisant le programme Chromquest (Thermo Scientific). Ces données ont été tracées en utilisant le programme Sigmaplot (logiciel Systat), et une constante de vitesse calculée en μ M / min basée sur la réduction de l’AUC intégrée du pic oligonucléotidique comme réaction avec 2 progressé (voir les informations de support pour plus de détails). calculs de taux). Des études de cours similaires ont été effectuées pour les autres oligonucléotides (Seq-2 à Seq-8), et les courbes de temps et les constantes de vitesse sont montrées sur la figure &#x200B, la figure 44 et le tableau 1, respectivement. Contrairement aux rapports de la littérature indiquant que les PBD ont un rang de préférence pour 5 ′ -Pu-G-Pu-3 ′ > Pu-G-Py ∼ Py-G-Pu > Séquences Py-G-Py, 8,18 le taux de formation d’adduits pour la réaction de 2 avec Seq-1 à Seq-8 a été trouvé pour être Py-G-Py > Py-G-Pu > Pu-G-Py / Pu-G-Pu (où Pu = A et Py = T), le contraire de celui attendu.En outre, la préférence pour TGT était cohérente pour les deux sites de liaison dans l’épingle à cheveux, ce qui suggère qu’il est indépendant de l’orientation adduct.Figure 3 (A) Seq-1 seul à la température de 26,0 min. (B) 30 minutes après avoir mélangé Seq-1 avec 2; Diminution de 95% de la surface du pic Seq-1 à la température ambiante de 26 min, et apparition de l’adduit Seq-1/2 à la température ambiante de 27,0 min. (C) Comme dans le panneau B mais 60 min après le mélange lorsque la réaction presque complète s’est produite. Figure 4 Temps de réaction de 2 avec les huit oligonucléotides Seq-1 à Seq-8 (tableau 1) mesurée par réduction de l’ASC pour chaque oligonucléotide avec le temps. Bien que tous les oligonucléotides aient complètement réagi en moins de 60 minutes, ceux contenant une liaison TGT-5 … Pour mieux comprendre ces résultats surprenants, des modèles moléculaires ont été construits des huit adduits, et des énergies libres ont été calculées pour l’interaction non covalente. avec chaque oligonucléotide en utilisant le logiciel AMBER (v9). Selon le modèle, les constantes de vitesse plus élevées obtenues pour les séquences TGT et TGA avec l’anneau PBD A orienté dans la direction 3 ′ (Figure & B; 2B) impliquent que le proton N10 de l’anneau B peut se lier à l’hydrogène soit au N3 d’une base d’adénine sur les côtés de la guanine modifiée de manière covalente (Figure 5A) 5A) soit de manière similaire. placé C2-carbonyle d’une base de thymine (figure ​ (figure 5B) .5B). Cependant, il semble y avoir une préférence pour la thymine par rapport à l’adénine (c.-à-d., Taux = 0,808 ± 0,008 et 0,196 ± 0,004 μ M / min pour TGT [Seq-6] vs TGA [Seq-8 ], respectivement). D’autre part, selon le modèle, avec la bague PBD A orientée dans la direction 5 ′ (figure ​ (figure 2A), 2A), l’anneau B N10-proton ne peut que lier l’hydrogène avec l’opposé base de brin complémentaire de la base sur les côtés de la guanine modifiée de manière covalente. Pour les deux séquences réactives les plus rapides, TGT (Seq-2) et TGA (Seq-4) (c.-à-d., Taux = 0,506 ± 0,012 et 0,364 ± 0,012 μ M / min, respectivement), est un adénine dans les deux cas. Ceci est le premier rapport d’un adduit de monomère PBD orienté sur 5 ′ et la liaison hydrogène potentielle du proton PBD N10 au brin lié de manière non covalente. Cependant, un modèle similaire a été proposé pour l’interaction d’une unité PBD du dimère PBD SJG-136 avec l’ADN lors de la formation d’une reticulation intrastrand.15 Figure 5 Modèles moléculaires minimisés par l’énergie de 2 attachés de manière covalente à Seq-5 (A) et Seq -6 (B) selon l’arrangement indiqué sur la figure ​ Figure2B, 2B, montrant les interactions possibles de liaison hydrogène du proton PBD N10-H avec les deux différents … Enfin, les résultats des calculs d’énergie libre (Tableau 1), qui se rapportent à la stabilité thermodynamique des adduits PBD-ADN, sont en accord avec les rapports de la littérature selon lesquels l’orientation préférée d’un produit d’addition PBD est avec l’anneau A pointant vers l’extrémité covalente brin d’ADN modifié. Par exemple, entre des paires d’oligonucléotides avec AGA (Seq-1 et Seq-5), TGT (Seq-2 et Seq-6), AGT (Seq-3 et Seq-7), et TGA (Seq-4 et Seq- 8), des énergies plus faibles ont été obtenues pour l’orientation 3 ′ (pour Seq-5, Seq-6, Seq-7 et Seq-8) dans chaque cas. Cependant, ces différences d’énergie sont faibles, et les résultats CLHP démontrent clairement que les PBD peuvent former des additifs avec des vitesses de réaction élevées (par exemple, Seq-2 et Seq-4). En conclusion, ceci est le premier rapport de comparaison. Données cinétiques pour la réaction d ‘un monomère PBD avec des oligonucléotides isomères de séquences variables. De telles données ne peuvent pas être obtenues à partir de méthodes à base de gel et sont uniquement rendues possibles grâce à l’échantillonnage rapide réalisable avec HPLC et l’utilisation de MS pour la confirmation des structures d’adduct. Les résultats sont en accord avec la littérature en ce que, sur la base des données cinétiques, 2 semble avoir une préférence cinétique pour la liaison à l’ADN avec son cycle A orienté vers l’extrémité 3 ‘du brin modifié par covalence. Cependant, en l’espace de 60 minutes, tous les huit oligonucléotides ont complètement réagi, démontrant ainsi que les deux adjuvants peuvent être importants d’un point de vue biologique. En outre, contrairement à la littérature, les résultats démontrent que, au moins pour les séquences étudiées, une base thymine plutôt qu’adénine est préférée sur le côté cycle A de la guanine modifiée de manière covalente. Ceci peut être expliqué par notre modèle, qui montre que l’atome d’oxygène C2-carbonyle de la thymine réside dans la même position dans l’espace que le N3 de l’adénine. Pris ensemble, ces résultats sont significatifs pour fournir une meilleure compréhension au niveau moléculaire de la façon dont les molécules PBD interagissent avec l’ADN, et devraient aider à interpréter les résultats des dosages à base de gel tels que l’empreinte ADN, l’arrêt de transcription in vitro et l’EMSA.