Résistance à l’artémisinine au Cambodge: un essai clinique conçu pour répondre à un problème émergent en Asie du Sud-Est

Contexte Les taux croissants d’échec de la polythérapie à base d’artémisinine ont mis en évidence la possibilité de résistance émergente à l’artémisinine le long de la frontière thaïlando-cambodgienne. Nous avons utilisé une approche in vivo in vitro intégrée pour évaluer la résistance à l’artémisinine dans l’ouest du Cambodge. d’un essai clinique publié dans le New England Journal of Medicine Méthodes Quatre-vingt-quatorze patients adultes de la province de Battambang (ouest du Cambodge) présentant un paludisme à falciparum non compliqué ont été randomisés pour recevoir un traitement par artésunate à forte dose mg / kg / jour par voie orale pendant plusieurs jours. ou quinine-tétracycline Les concentrations plasmatiques de dihydroartémisinine, la sensibilité aux médicaments in vitro et les marqueurs moléculaires ont été analysés. Les cas répondant à tous les critères suivants ont été classés comme résistants à l’artémisinine: échec de l’élimination des parasites dans les jours suivant le traitement ou réémergence des parasites dans les jours suivant le suivi; des concentrations plasmatiques adéquates de dihydroartémisinine; clairance parasitaire prolongée; et augmentation des niveaux de sensibilité aux médicaments in vitro pour les dihydroartémisinines Résultats Deux% des patients traités par artésunate ont été classés résistants à l’artémisinine. Leur temps de clairance parasitaire a été prolongé et h, comparé à la médiane h chez les patients guéris. Ces patients présentaient des concentrations inhibitrices de dihydroartémisinine Les résistances à l’artémisinine ont émergé à la frontière thaïlando-cambodgienne. Les conséquences potentiellement dévastatrices de l’extension de la résistance à une résistance à l’artémisinine sont apparues le long de la frontière entre la Thaïlande et le Cambodge. médicament qui n’a actuellement aucun successeur appel à d’autres études de ce problème émergentClinical essai d’enregistrement ClinicalTrialsgov identifiant NCT

Bien qu’ils soient les médicaments antipaludiques les plus efficaces et les plus rapides actuellement disponibles, l’utilisation généralisée des artémisinines dans le traitement du paludisme à Plasmodium falciparum rend le contrôle du paludisme plus vulnérable aux conséquences de la pharmacorésistance dans la situation actuelle. L’impératif épidémiologique de détection précoce de la résistance émergente à l’artémisinine en Asie du Sud-Est pour protéger les combinaisons thérapeutiques à base d’artémisinine Les CTA dans tout le monde endémique du paludisme méritent des efforts de surveillance réguliers Nous avons utilisé une définition stricte de l’artémisinine clinique résistance et a mené un essai clinique qui a été spécifiquement conçu pour répondre à la question de savoir si la résistance à l’artémisinine clinique est déjà apparue Cet article fournit des détails et des données supplémentaires sur un essai clinique précédemment publié dans le New England Journal of Medicin. e

Méthodes

f enveloppes scelléesStudy drugs Les sujets ont été répartis pour recevoir l’un des schémas antipaludiques suivants: artésunate, mg mg / kg administré par voie orale une fois par jour pendant plusieurs jours dose adulte, comprimés mg -mg [Guilin Pharmaceutical Works]; fourni par Atlantic Pharmaceuticals; ou sulfate de quinine, mg / kg / jour, administré par voie orale en doses fractionnées pour les comprimés de -mg jours; Organisme pharmaceutique gouvernemental plus tétracycline, mg / kg / jour, administré par voie orale en doses fractionnées pour les comprimés de -mg jours; Les médicaments antipaludiques New Life Pharma ont été administrés sous surveillance directe avec des repas ou des collations. Patients pour lesquels l’artésunate en monothérapie a échoué. Traitement après traitement par quinine-tétracycline pendant plusieurs jours.Évaluations Après l’inclusion, résultats de l’examen physique, signes vitaux, effets indésirables, signes cliniques et médicaments. les antécédents ont été enregistrés et répétés quotidiennement jusqu’au jour et par la suite les jours, et et chaque fois que des signes et symptômes correspondant au paludisme ou à toute autre maladie ou événement indésirable réapparaissaient pendant le suivi de jour. Le test urinaire était effectué le jour de l’enrôlement. Le sang a été prélevé pour la réaction en chaîne de la polymérase. Le génotypage par PCR et le test de sensibilité in vitro aux médicaments ont été effectués quotidiennement et en cas d’échec du traitement au cours du suivi.Microscopie Des frottis sanguins épais et minces ont été préparés dupliquer deux fois par jour, jusqu’à ce que le sujet Des frottis supplémentaires ont été préparés les jours,, et à n’importe quel moment de cette période si les signes et les symptômes associés au paludisme réapparaissaient. Le diagnostic du paludisme et le dénombrement des plasmodies étaient basés sur: Diapositives colorées au Giemsa qui ont été examinées par des experts en microscopie aveuglant les résultats des autres chercheurs. Les lames de sang préparées pour tous les patients présentant un échec thérapeutique ont été testées pour les corps Howell-Jolly afin d’exclure l’hyposplénisme Efficacité Les mesures de l’efficacité du traitement étaient fondées sur les critères établis par l’Organisation mondiale de la santé . Le principal critère d’évaluation était une réponse clinique et parasitologique adéquate. L’échec thérapeutique était divisé en échec thérapeutique précoce, échec clinique tardif et échec parasitologique tardif. les variables d’efficacité étaient le temps de clairance parasitaire et la fièvre Les échantillons de sang hépariné ont été prélevés juste avant et à et h ± min après l’administration de la première dose d’artésunate le jour. Les échantillons ont été centrifugés immédiatement et le plasma a été conservé à – ° C avant d’être transféré à – ° C en dihydroartémisinine. les niveaux ont été déterminés par chromatographie en phase liquide-spectrométrie de masse, comme décrit ailleurs Tout sujet pour lequel la moyenne des mesures était inférieure à la moyenne globale – SD n’a pas été considéré comme ayant une exposition adéquate aux médicaments prouvée Test in vitro de sensibilité aux médicaments Les échantillons frais parasités L’admission et la recrudescence ont été testées dans un essai de susceptibilité aux protéines riches en histidine pour leur sensibilité au DHA et un panel standard d’antipaludiques, y compris la méfloquine. Des cultures et des tests de sensibilité aux médicaments ont été réalisés comme décrit ailleurs. Le clone WP falciparum référence et pour le contrôle de la qualité de drug-co Plaques identifiées Identification moléculaire de l’infection recrudescente Des méthodes précédemment décrites utilisant des protéines de surface de mérozoïtes et des PCR nichées ont été utilisées pour confirmer que les parasites réapparaissaient reflétant de vraies recrudescences chez les deux sujets considérés comme pharmacorésistants. avec les instructions du fabricant L’amplification a été réalisée dans un volume total de μL, comme indiqué ailleurs Nombre de copies Pfmdr Le nombre de copies Pfmdr a été mesuré par TaqMan-Minor Rainure Binding PCR en temps réel sur le système ABI HT Sequence Biosystems les séquences d’amorce et de sonde décrites pour pfmdr et la sonde pour la ß-tubuline ont été utilisées, tout comme les amorces de ß-tubuline construites, au moyen de la version Primer Express; Applied Biosystems Une amplification par PCR PfATPase de type SERCA des régions Pf-ATPase a été réalisée en utilisant les ensembles d’amorces suivants pour la région, -AGCATGCTGTTATAGAA- ‘et’ -TGAATTGGAT CTGAGAAATGT- ‘; pour la région, l’ADN ‘-AAATATGGGAAAA AGAGCATTAA-‘ et ‘-TACACGTA-TACCAGCCATATGG-‘ a été purifié en utilisant un kit de filtrage Millipore-Montage. L’analyse de séquençage Millipore a été réalisée avec un MJ Research PTC-Peltier Thermal Cycler MJ Research en utilisant AmpliTaq DNA polymérase Applied Biosystems et un ABI Prism Kit de séquençage de cycle BigDye Terminator Biosystem appliqué Les conditions étaient conformes aux protocoles de fonctionnement standard fournis par le fabricant. Les échantillons ont été analysés par l’analyseur ABI XL Applied Biosystem

Résultats

Patients Cent vingt-trois sujets ont subi un dépistage; de ceux-ci, ont rempli les critères d’entrée et ont été randomisés pour le bras de traitement artésunate en monothérapie; n p ou bras de traitement thérapie quinine-tétracycline; n = Figure Les cohortes étaient bien appariées en ce qui concerne le poids, l’âge, les antécédents médicaux et la sévérité de la maladie Tableau En dépit d’un échantillonnage aléatoire, beaucoup plus de patientes ont été incluses dans le groupe artésunate et la densité parasitaire était plus élevée dans le groupe témoin Soixante patients étaient évaluables pour l’analyse du critère de jugement principal dans le bras et les patients dans les bras

Figure View largeDownload slideNombre de patients éligibles à l’étude, randomisés pour recevoir une monothérapie à l’artésunate ou à la quinine-tétracycline, et surveillés pendant plusieurs jours P vivax, Plasmodium vivaxFigure View largeTableau de téléchargementNombre de patients éligibles à l’étude, randomisés pour recevoir monothérapie à l’artésunate ou à la quinine-tétracycline, et suivi pendant plusieurs jours P vivax, Plasmodium vivax

Tableau View largeTélécharger slideDémographique Caractéristiques et résultats de laboratoire au départ, par Thérapie ReceivedTable View largeTélécharger diapo Caractéristiques démographiques et résultats de laboratoire au départ, par traitement reçu Efficacité clinique L’estimation de probabilité de Kaplan-Meier pour une réponse clinique et parasitologique adéquate au jour était%% intervalle de confiance. ],% -% Dans le groupe témoin,%% IC,% -% des patients ont été guéris. Les patients du tableau 4 dans le bras artésunate ont eu une réémergence des parasites P falciparum pendant le suivi; ont été classés comme présentant un échec parasitologique tardif et comme présentant une insuffisance clinique tardive. Tous les échecs de traitement

Tableau View largeTélécharger des mesures d’efficacité secondaires et secondaires pour les deux groupes de traitementTable View largeTélécharger des mesures d’efficacité secondaires et secondaires pour les deux groupes de traitement Dans le bras artésunate,% de patients% CI,% -% avaient encore la parasitémie après la première évaluation et% de patients % CI,% -% avait une parasitémie après h Dans le groupe quinine-tétracycline, les pourcentages correspondants étaient%% IC,% -% et%% IC,% -%, respectivement. Les temps de clairance parasitaire médiane étaient plus faibles P = dans le bras artésunate h [intervalle interquartile {IQR}, – h] que dans le groupe témoin h [IQR, – h], les temps de clairance fébrile n’étaient pas différents h [IQR, – h] et h [IQR, – h], respectivement P = Le temps de clairance parasitaire médian chez les patients qui ont développé plus tard une recrudescence était h IQR, – h, comparé à h IQR, – h chez les patients guéris. Les sujets par la suite résistants à l’artémisinine présentaient des temps de clairance parasitaire et hPharmacokinetics Plasm Les niveaux de DHA mesurés à et h après l’ingestion de médicament le jour ont été utilisés pour déterminer si l’exposition médicamenteuse avait été adéquate chez les patients traités par l’artésunate. La concentration plasmatique moyenne de DHA à h était de ± nmol / L, et h était ± nmol / L Des concentrations adéquates de DHA ont été définies comme étant les taux plasmatiques moyens sériques individuels chez les sujets pour qui le traitement par l’artésunate a échoué sont présentés dans le tableau en l’absence d’un échantillonnage pharmacocinétique plus détaillé, et n’ont pas répondu à notre définition de concentrations plasmatiques adéquates de médicament, tandis que l’autre a démontré des concentrations plasmatiques acceptables de DHA

Tableau View largeTélécharger diapositivesDihydroartémisinine DHA Concentrations, sensibilité aux médicaments intrinsèques, et paramètres de réponse au traitement pour les patients pour qui l’artésunate monothérapie a échoué, par exemple, « échec des cas » Tableau Voir grandDownload slideDihydroartémisinine DHA Concentrations, sensibilité aux médicaments intrinsèques et paramètres de réponse au traitement pour les patients pour qui artésunate Échec de la monothérapie, c.-à-d. Échecs de traitement Les taux de médicament, la sensibilité intrinsèque aux médicaments et les paramètres de réponse au traitement chez les patientes pour lesquelles l’artésunate monothérapie a échoué sont indiqués dans le tableau et l’analyse PCR des échantillons de sang appariés le jour et le jour de la recrudescence , chez les patients ayant présenté un échec du traitement, ont montré des profils de bandes identiques pour les deux gènes de P falciparum, comparés au jour de l’infection, ou un sous-ensemble du profil de baguage d’origine, confirmant que ces cas sont de véritables recrudescences

DiapositiveTaille de téléchargementTarifs de drogue, sensibilité intrinsèque aux médicaments et paramètres de réponse au traitement pour les patients pour qui l’artésunate monothérapie a échouéVoir grandDownload Niveaux de drogue, sensibilité aux médicaments intrinsèques et paramètres de réponse au traitement pour les patients pour qui l’artésunate a échoué le jour de l’inscription, échantillons%; % CI ont été testés avec succès pour leur sensibilité in vitro aux DHA La concentration inhibitrice de DHA% IC déterminée pour le clone de référence W était nmol / L La moyenne géométrique globale IC dans tous les échantillons testés avec succès pour DHA n = était nmol / L% CI, – nmol / L Le CI DHA pour les patients guéris après un traitement par artésunate était nmol / L% IC, – nmol / L, comparé à nmol / L, – nmol / L dans les échantillons de patients classés comme résistants P = DHA ICs pour les échantillons recueillis le jour de la recrudescence étaient similaires aux échantillons correspondants recueillis le jour P = DHA CI ont été corrélés r =; P = avec clairance parasitaire dans le bras de traitement Nombre de copies Pfmdr Le nombre de copies médian dans les échantillons était la plage de copie, – copies Lorsque les numéros de copie étaient arrondis à l’entier le plus proche,%; % CI,% -% de ces échantillons avaient un numéro de copie & gt ;, et seuls les échantillons avaient un numéro de copie & gt; Le nombre de copies médian chez les patients ayant eu un échec thérapeutique était de l’ordre de la copie, – les copies de numéros de copies Pfmdr n’étaient pas corrélées avec les résultats cliniques, le temps d’élimination des parasites r =; P =, temps de clairance de la fièvre r =; P =, ou DHA ICsr =; P = Cependant, ils ont corrélé avec les CI de méfloquine r =; Les régions de codage de PfATPase de type SERCA autour des résidus et de tous les échantillons ont été séquencées Les résultats de l’ensemble limité de polymorphismes testés ont montré que tous les échantillons partageaient une séquence nucléotidique identique avec l’allèle D. Aucune modification des séquences codantes des patients avec recrudescence ou ceux qui ont une guérisonSécurité et tolérance Les événements indésirables liés au médicament dans leur ensemble étaient significativement plus fréquents dans le groupe témoin que dans le groupe artésunate P & lt; Aucun effet indésirable grave n’a été observé au cours de cette étude. L’évaluation de la qualité des médicaments a été déterminée pour les échantillons de médicaments choisis au hasard. La teneur moyenne en artésunate de CI était de mg – mg ou% -% les échantillons avaient des teneurs en artésunate dans les limites permises% -% de

Discussion

L’opinion générale est que plusieurs facteurs protègent les artémisinines du développement de la résistance: la demi-vie plasmatique courte du composé d’origine et de son métabolite actif, la rapidité avec laquelle les médicaments éliminent les deux types d’artémisinine. les parasites asexués et sexuels, et, enfin, la présence d’un médicament partenaire efficace d’une classe différente d’antipaludiques, ce qui devrait protéger le composant artémisinine, la prémisse sur laquelle repose le concept de polythérapie à base d’artémisinine Cette approche suppose Cependant, avec une activité réduite des médicaments partenaires, les parasites qui ont été exposés aux artémisinines, mais non éliminés, ont une plus grande probabilité de survivre aux thérapies combinées avec une durée typique de traitement par l’artémisinine pendant les thérapies combinées, le composant d’artémisinine dans un ACT est administré de manière cohérente à des doses sous -uratives, Plus récemment, il a été suggéré que l’idée selon laquelle les combinaisons protègeraient les artémisinines est trop optimiste, et des rapports sur les échecs thérapeutiques et la réduction de la sensibilité aux médicaments in vitro ont commencé à apparaître [ -] Les données in vitro sur la susceptibilité à l’artémisinine du Sénégal, du Cambodge et de la Guyane suggèrent une diminution de la sensibilité aux médicaments suite à l’utilisation incontrôlée des dérivés de l’artémisinine Dans une zone relativement petite du sud-est de la Thaïlande. un nombre croissant d’échecs après traitement par artésunate-méfloquine a été rapporté%; pas corrigé pour les réinfections; ces chiffres ont ensuite été confirmés par nos propres investigations L’artémisinine en monothérapie, en général, est fortement déconseillée dans les zones où le paludisme est endémique. Elle a été utilisée dans de nombreux contextes précédents, avec des taux de succès variables. En raison de la conception de ces études, il n’est pas possible d’attribuer les échecs de traitement dans ces études à la résistance. En raison des limites connues de la plupart des plans d’étude, nous avons choisi de étudier la résistance potentielle à l’artémisinine en utilisant des critères stricts pour définir la résistance et l’artésunate en monothérapie, pour éliminer l’effet confusionnel du médicament partenaire lors de l’interprétation des paramètres parasitologiques ou cliniques. La résistance stable à P falciparum est une condition sine qua non de la transmission de l’artémisinine en milieu clinique. induction d’une résistance stable à l’artémisinine dans un modèle animal a été rapportés de Plasmodium chabaudi et pourraient être considérés comme un précédent que la résistance à l’artémisinine peut être induite de manière stable Les CI les plus élevés trouvés dans cette étude sont presque plus élevés que ceux trouvés dans le clone de référence W et sont compatibles avec les récents la même région Comparativement aux données in vitro publiées précédemment provenant de l’ouest de la Thaïlande, les CI DHA mesurés dans cette étude étaient significativement plus élevés, suggérant une différence majeure de sensibilité intrinsèque à l’artémisinine comparé à une région qui, malgré des niveaux élevés de résistance à la méfloquine Les durées de clairance parasitaire rapportées dans la présente étude sont significativement plus élevées que celles que nous avons mesurées à la frontière médiane de la frontière ouest thaïlandaise, h [référence] vs h dans cette étude. étude P & lt ;, indiquant une sensibilité plus faible à l’artémisinine dans notre site dans l’ouest du Cambodge que je n Thaïlande occidentale Cette découverte a été confirmée par un essai de monothérapie d’artésunate multicentrique récemment publié qui a démontré des temps de clairance parasitaire significativement plus élevés dans l’ouest du Cambodge On ne peut plus supposer qu’une réduction de l’efficacité d’un ACT est uniquement le résultat de L’étude confirme la nécessité de surveiller de manière indépendante l’efficacité et la susceptibilité du composant artémisinine des ACTs, en particulier quand il y a des rapports d’efficacité décroissante en utilisant un traitement combiné Bien que les ACT continuent d’être très efficaces au niveau mondial, des études sont en cours Pour comparer l’efficacité de l’artémisinine dans les régions où l’artémisinine est peu utilisée, vérifier si les cas de résistance apparente à l’artémisinine, tels que ceux rapportés ici, représentent un phénomène d’expansion temporelle et géospatiale ou si les clones naturellement résistants un sous-ensemble fixe de para populations de sites de différents endroits Des stratégies de recherche, de surveillance et de confinement coordonnées et détaillées sont urgemment justifiées pour optimiser l’utilisation actuelle des artémisinines et limiter l’effet de la résistance émergente à un médicament qui n’a actuellement pas de successeur

Remerciements

Nous remercions tous les participants, ainsi que le personnel du Centre de santé de Tasanh, pour leur coopération et leur assistance. Nous remercions également tous les collègues et collaborateurs pour leur soutien et leur contribution scientifique, et David Saunders pour l’examen des manuscrits et le soutien au processus de publication. Centre de surveillance de la santé des Forces armées – Programme des infections émergentes dans le monde Conflits d’intérêts potentiels Tous les auteurs: aucun conflitDisclaimer Les opinions ou affirmations contenues dans ce document sont les opinions personnelles de l’auteur et ne doivent pas être interprétées comme officielles ou reflétant les véritables opinions du Ministère. de l’armée ou du ministère de la Défense