Inhibiteurs à base de bis-phosphate de mannitol des aldolases de 1,6-bisphosphate de fructose

Maladies parasitaires causées par les trypanosomatidés (Chagas &#x02019, maladie, maladie du sommeil, leishmaniose, …) sont membres de “ maladies négligées ” Les deux sous-espèces infectieuses humaines de Trypanosoma brucei, T. b. gambiense et T. b. rhodesiense, causent 66 000 décès chaque année dans de nombreux pays d’Afrique subsaharienne, et 50 autres millions de personnes risquent de contracter la maladie2. L’impact social de la maladie est aggravé par l’infection massive du bétail dans ces pays par un autre. sous-espèce, T. b. brucei. Les parasites résident dans la circulation sanguine des patients infectés, et la glycolyse représente le seul processus métabolique à travers lequel leur ATP est synthétisée.3 Cette voie est considérée comme une cible thérapeutique prometteuse dans la lutte contre les infections à T. brucei.4 Des rapports récents ont montré que une déplétion partielle de certaines enzymes glycolytiques conduisant à la réduction du flux glycolytique à environ 50% des niveaux de type sauvage est suffisante pour tuer les parasites en culture.5,6 Dans la forme sanguine T. brucei, fructose bis-phosphate aldolase (FBA) a été génétiquement validé en tant que cible de médicament par interférence ARN. Les humains ont trois isoenzymes aldolases localisées dans différents tissus: le type A dans les muscles et les érythrocytes, le type B dans le foie et le type C dans le cerveau post-partum. Par conséquent, les médicaments ciblant l’aldolase devront être spécifiques de l’aldolase de T. brucei par rapport aux aldolases humaines. Le pourcentage global d’identité de séquence entre chacune des aldolases humaines et T. brucei aldolase est de 47% .7 La structure cristalline du FBA de T. brucei a été déterminée et présente d’importantes similitudes avec les enzymes humaines, rendant difficile la conception et la synthèse d’inhibiteurs sélectifs .8 En dépit de différences subtiles seulement entre les FBA provenant de ces deux organismes, la synthèse de quelques inhibiteurs sélectifs a été rapportée.9L’inhibiteur compétitif du FBA est l’hexitol bis-phosphate, qui a été préparé chimiquement à l’origine par réduction du fructose bisphosphate (FBP) 10 en mélange de diastéréoisomères, de glucitol bisphosphate (GBP) et de mannitol bisphosphate (MBP). Nous avons précédemment rapporté la synthèse séparée et l’évaluation biochimique de ces deux produits.11 MBP est significativement plus actif (14 fois) en tant qu’inhibiteur de la FBA que la contrepartie de glucitol. Ceci est en accord avec l’étude structurale des cristaux de FBA de lapin-muscle imbibés de solutions d’hexitol bis-phosphate, où seul le manno constituant du mélange était lié dans le site actif.12 MBP interagit fortement avec plusieurs résidus de l’enzyme de mammifère: le P1-phosphate13 établit de fortes liaisons hydrogène avec Ser 271, Arg 303, Gly 302 et Gly 272 tandis que le fragment P6-phosphate établit des liaisons hydrogène avec Ser 35, Ser 38 et Lys 107 et avec le squelette peptidique à Glu 34 et Ser 35 Les trois groupes hydroxyle en C-2, C-3 et C-4 interagissent également avec les résidus du site actif mais, ce qui est intéressant, pas l’hydroxyle en C-5, où il semble y avoir une grande poche vide. Le résidu le plus proche est situé à 5,6 Å de l’hydroxyle C-5. Une situation similaire est observée chez Trypanosoma brucei FBA, où le locus putatif de liaison C-5 aurait une poche encore plus grande.14 L’absence de résidus de sites actifs en interaction avec l’hydroxyle C-5 de MBP ou dans le substrat naturel fructose bis-phosphate est compatible avec d’autres composés qui sont des substrats de FBA mais diffèrent dans les substituants à l’hydroxyle C-5 (Figure 11) .15 − 18 Sur la base de cette observation, nous avons raisonné qu’en ajoutant des groupes alkyle volumineux sur O-5 ou C-5 de la MBP, il pourrait être possible de préparer des inhibiteurs sélectifs de FBA parasitaires incapables d’entrer dans le site actif de l’enzyme humaine (Figure 2) .2) Alternativement, des inhibiteurs sélectifs irréversibles portant un groupe électrophile pourrait être conçu.Figure 1 Substrats de FBA avec différents substituants en C-5 (ou un hydroxyle manquant) par rapport à FBP: l-SBP, l-sorbose bis-phosphate, d-XP, d-xylulose bis-phosphate; d-SHBP, bis-phosphate de d-sedoheptulose, 5-d-FBP, 5-deoxy-fructose bisphosphine ate.15 − 18Figure 2Inhibiteurs dérivés du bisphosphate d’hexitol de FBA. La première étape de cette stratégie est présentée ci-dessous. Elle consiste à valider que les dérivés de MBP portant un groupe alkyle en O-5 conservent leur capacité inhibitrice.19 La stratégie de synthèse de cette classe de composés est résumée dans le Schéma 1.Schéma 1Synthèse de dérivés 5-O-alkyliques du Mannitol Bis-phosphateAs a été rapporté précédemment, la déprotection en deux étapes du produit final est rendue nécessaire par une éventuelle migration des groupes phosphate s’ils étaient débenzylés après les hydroxyles.11 De même, la stratégie menant aux dérivés C-5 à partir de l’intermédiaire clé du schéma 1 est donné dans le schéma 2.19 L’étape d’alkylation implique la réaction d’un réactif organométallique sur une fonction carbonyle qui pourrait conduire à un mélange de deux diastéréoisomères. Sur la base des spectres RMN, un seul diastéréoisomère a été obtenu dans tous les cas et a été assigné à la configuration d-manno, conformément à la règle Akin Felkin – Schéma 2 Synthèse des dérivés 5-C-alkyle du mannitol Bis-phosphateCes composés ont été testés par des méthodes standard pour leurs propriétés inhibitrices sur FBA du muscle de lapin (pris comme modèle de substitution de FBA humain, avec 98% d’identité) et sur FBA de Trypanosoma brucei (enzyme recombinante marquée par His exprimée dans E. coli). 20 Les résultats sont reportés dans le tableau 1.Tableau 1 Données d’inhibition enzymatique mesurées en présence de substrat / inhibiteurs21 Les composés 1 et # x02013; 7 ont été montrés par des courbes réciproques doubles pour agir comme inhibiteurs compétitifs sur le FBA de T. brucei, en accord avec les résultats précédemment obtenus. le composé parent MBP. L’inhibition compétitive pour le composé 1 est corroborée par les études cristallographiques. Par rapport à 1, les inhibiteurs 2 – 7 montrent une sélectivité limitée pour Tb-FBA par rapport aux FBA de mammifères. Une stratégie de substitution a été entreprise pour sonder la base structurale de la discrimination accrue du composé 1 entre les deux enzymes FBA. La structure de l’aldolase du muscle du lapin en complexe avec le composé 1 a d’abord été déterminée puis modélisée par superposition sur la structure de T. brucei aldolase (code d’entrée PDB 1F2J) pour obtenir des informations structurelles sur les différences d’affinité du composé 1 La détermination de la structure cristalline du complexe enzymatique formé par trempage des cristaux d’aldolase de muscle de lapin en présence du composé 1 est décrite dans les Informations de support et résumée dans le Tableau S1. La structure cristalline du complexe résultant formé avec le composé 1 est montrée sur la figure 3 Figure 33. Figure 3 Densité d’électrons montrant le composé 1 piégé dans le site actif de l’aldolase de muscle de lapin.Le composé 1 pourrait être adapté à la densité électronique en utilisant deux orientations qui sont symétriques par rapport à un axe de rotation 2 centré sur le C3. La densité électronique correspondant à la liaison du composé 1 est continue et a été facilement interprétée. en tant que composé 1 se liant dans le site actif dans deux orientations symétriques et entièrement chevauchantes, chacune d’une occupation égale qui correspond à l’occupation complète du site actif sur la base de la comparaison du facteur B avec les résidus voisins. Le composé 1 lié dans le site actif de l’aldolase de muscle de lapin et son mode de liaison était similaire à celui de la MBP, comme décrit précédemment12 et représenté sur la figure 4a. Figure 4: Superpositions de la structure cristalline de l’aldolase du lapin et de T. brucei. aldolase montrant les interactions de liaison du composé 1. (a) Comparaison de la liaison du ligand dans le site actif de l’aldolase du muscle de lapin. Superposition du muscle de lapin … Le composé 1 pénètre légèrement plus profondément dans le site actif à la position 5-O-méthyle par rapport à la liaison par MBP; cependant, il ne fait aucun contact supplémentaire avec les résidus de site actif. La superposition de la structure aldolase de muscle de lapin liée au composé 1 sur la structure cristalline de T. brucei aldolase (rmsd 0.603 Å) a révélé que pour un mode de liaison. ​ Figure4b, 4b, le groupe 5-O-méthyle du composé 1 ferait un contact hydrophobe supplémentaire (van der Waals) avec le groupe méthyle du résidu de site actif Ala-312. Dans l’aldolase de muscle de lapin, Gly-302 est le résidu est équivalent à Ala-312 dans T. brucei aldolase et ne fait pas de contact étroit avec le 5-O-méthyle du composé 1. Il représente la seule différence d’acides aminés entre les deux sites actifs et est indiqué dans l’alignement de l’acide aminé séquences pour le muscle de lapin et les aldolases de T. brucei (tableau S2 de l’information de support). L’interaction supplémentaire de van der Waals faite entre le 5-O-méthyle du composé 1 et le groupe méthyle Ala-312 serait ainsi responsable de l’inhibition plus puissante de T. brucei aldolase par le composé 1, présenté dans le tableau 1. La pénétration plus profonde du groupe 5-O-méthyle aliphatique dans le composé 1 dans une région du site actif revêtue principalement de carbones aliphatiques ne serait pas incompatible avec cette interprétation. De plus, l’utilisation de la même procédure de modélisation et la superposition des structures ligandées de l’aldolase de lapin liée à FBP et MBP12 prédit des interactions identiques entre FBP et MBP dans T. brucei aldolase, et aucun ligand n’entretient de contact étroit avec Ala-312 (données non présentées). Les interactions indiscernables par FBP et MBP dans les deux aldolases sont cohérentes avec leurs valeurs Km et IC50 similaires dans les deux aldolases, présentées dans le tableau 1, et corroborent la stratégie de modélisation des substituts. La modélisation des composés 2, 3 et 4 en utilisant le composé 1 comme matrice conduirait à des collisions stériques avec des résidus de sites actifs dans les deux aldolases, nécessitant des modes de liaison différents de ceux observés pour FBP, MBP et le composé 1 et vraisemblablement d’affinité inférieure, Comme montré dans le tableau 1. De même, la modélisation des modes de liaison pour les composés 5, 6 et 7 basée sur celle du composé 1 n’a pas pu être accommodée en raison des collisions stériques dans le site actif des deux aldolases et cohérentes avec les interactions du site actif. une affinité plus faible pour ces composés, comme le montre le tableau 1. La sélectivité actuelle, ne dépassant pas un facteur de 4, est évidemment trop faible pour une utilisation thérapeutique. Un résultat positif, cependant, est que les dérivés de MBP portant des groupes volumineux à O-5 (C-5) conservent des propriétés inhibitrices appréciables. La modélisation du groupe 5-O-CH2F dans le composé 1 suggère la liaison par un tel composé lors de l’ajustement du site actif; cependant, le gain en énergie d’interaction dépasse rarement 1 kcal / mol.22 À cet égard, des dérivés portant des fonctions réactives courtes en C-5 pourraient être introduits pour agir comme des inactivateurs sélectifs irréversibles. Les études proposées tireraient profit des calculs d’amarrage des composés liés dans le site actif des deux enzymes et suivis par la détermination de la structure de complexes inhibiteurs d’enzyme appropriés. Des études complémentaires à effectuer incluraient l’utilisation d’analyses mutationnelles de concert avec des données structurales et / ou cinétiques pour corroborer le rôle des résidus de sites actifs responsables de la sélectivité, comme décrit précédemment.23