Découverte d’AMG 369, un agoniste thiazolo [5,4-b] pyridine de S1P1 et S1P5

Le lysophospholipide sphingosine-1-phosphate (1, S1P)

a émergé comme une molécule de signalisation polyvalent, capable 1,2

d’impact sur un large éventail de fonctions cellulaires, y compris la prolifération

et l’apoptose, la différenciation et la migration. Les diverses activités

de S1P sont censés être médiatisés par son interaction avec le

cinq GPCR S1P (S1P1 − 5) codés par l’EDG (endothélial

gène de différenciation) ainsi que possible intracellulaire supplémentaire

target.1 − 6 La découverte que le puissant immunomodulateur FTY720 (fingolimod, 2) est phosphorylé in vivo en l’ester monophosphate FTY720P, 7,8 un agoniste de tous les GPCR S1P sauf S1P2, a déclenché une intense

la recherche sur les fonctions des différents récepteurs S1P (voir Figure ​ Figure 11 pour les structures). De ces études, un consensus

émergé que les effets immunomodulateurs de FTY720 sont principalement

en raison de l’agonisme et la régulation négative ultérieure du récepteur S1P1 par FTY720P, qui interrompt le modèle normal de lymphocyte

Il a également été établi que, chez les rongeurs, l’agonisme du récepteur S1P3 par FTY720P entraîne une réduction de la fréquence cardiaque9,10 semblable à celle observée chez les sujets humains11. résultats, combinés avec l’impressionnante efficacité de FTY720

dans des essais cliniques pour le traitement du rejet de greffe12 et de la sclérose en plaques, 13,14 ont mené à une vaste recherche d’agonistes S1P1 avec

activité au niveau du récepteur S1P3.15,16 Nous rapportons ici la découverte d’un double agoniste de la thiazolo [5,4-b] pyridine S1P1 / S1P5 (5d) et décrivons ses caractéristiques pharmacologiques et pharmacocinétiques in vivo.Figure 1S1P, FTY720,

benzothiazole 3a, et optimisé thiazolo [5,4-b] pyridine 5d (AMG 369). Précédemment, notre équipe de recherche a produit une série de puissants et sélectifs

agonistes du benzothiazole S1P1.17 Le composé 3a était représentatif de cette série

puissance nanomolaire à deux chiffres dans un dosage mesurant l’internalisation des récepteurs

(RI) d’une protéine de fusion hS1P1-GFP dans des cellules U2OS, et

il a montré une activité limitée à hS1P3 comme déterminé par

Mobilisation de Ca2 + dans des cellules CHO-K1 transfectées par hS1P3- et Gq / i5 (Tableau 1) .18 Le composé 3a a également démontré un mécanisme

l’activité chez le rat, avec une dose orale unique de 1 mg / kg produisant une

réduction des lymphocytes du sang circulant 24 h après l’administration. Cependant, 3a est caractérisé à la fois par une lipophilie relativement élevée

(CLogP = 3,9) et faible surface polaire topologique (tPSA = 53 Å 2), 19 et donc, il réside

dans une région d’espace physicochimique avec une probabilité plus élevée de

toxicité hors cible (CLogP > 3, tPSA < 75 Å 2) .20 Par conséquent, les modifications de 3a ont été

entrepris dans le but d’identifier les agonistes S1P1 avec

CLogP inférieur et tPSA supérieur. Azote unique pour substitutions CH

ont été identifiés comme un moyen d’abaisser CLogP (− 1,1 unités) et d’augmenter tPSA (+12 Å 2). Les trois possibles

analogues aza de 3a (3b Ȣ 3d) résultant de la substitution de l’azote à chaque benzothiazole C − H

position ont été étudiés (tableau 1) et trouvés

présenter une activité réduite (3 − perte de 10 fois vs 3a) dans le test d’internalisation du récepteur S1P1.

Aza-dérivés (4b − 4d) de l’isomère

6-benzyl-benzothiazole 4a ont également été étudiés, et

dans un cas, la substitution de l’azote à CH n’a entraîné aucune perte

en puissance (4d, S1P1 RI CE50 =

0,199 μ M) par rapport au parent (4a, hS1P1 RI CE50 = 0,221 μ M). Des six analogues aza, 3b, 3d et 4d ont manifesté

Puissance S1P1 (EC50 = 0,138 − 0,199 μ M)

et ont été sélectionnés pour une optimisation plus poussée. Tableau 1SAR des analogues de thiazolopyridine a donné la lipophilie élevée du ligand S1Pl endogène,

S1P (1, CLogP = 5.5), nous avons émis l’hypothèse que

la puissance des analogues d’aza pourrait être éliminée par l’ajout de

groupes lipophiles, dans le but de ne pas dépasser la lipophilie

de 3a (CLogP = 3,9). Après une exploration approfondie de plus

que soixante-dix analogues de 3b, 3d et 4d portant de petits groupes lipophiles, il a été constaté que le

α -méthylbenzyl analogues de 4d, les thiazolo [5,4-b] pyridines 5a − b (tableau 2), ont montré une amélioration de 5 fois de la puissance S1P1 et une perte de 2 fois l’activité de S1P3 par rapport à

le parent 4d. La substitution diméthylique de Geminal (5c) a abouti à une activité S1P1 comparable et à une activité de S1P3 réduite. Encouragé par ces résultats, benzylique 1,1-disubstitué

les carbocycles ont été étudiés (5d − g). De cette série, le 5d contenant du cyclopropane a été trouvé

présenter une puissance nanomolaire à un seul chiffre au niveau du récepteur S1P1 (EC50 = 0,002 μ M), avec beaucoup moins de puissance

activité au niveau du récepteur S1P3 (CE50 = 0,888

μ M). Les propriétés physicochimiques calculées de 5d (ClogP = 3.2, tPSA = 65 Å 2) étaient également favorables

par rapport à 3a (ClogP = 3,9, tPSA = 53 Å 2). Poursuite des tests de 5d dans une mobilisation de Ca2 +

le format a révélé un puissant agonisme du récepteur hS1P5 (EC50 = 0,029 μ M, 50% d’efficacité) et un manque d’activité à

récepteurs hS1P2 et hS1P4 aux concentrations

jusqu’à 2,5 μ M. L’activité S1P5 de 5d n’était pas considérée comme une responsabilité, car il a été suggéré que l’agonisme

des récepteurs S1P5 des oligodendrocytes par FTY720P peut contribuer

à l’efficacité de FTY720 (2) dans le traitement de multiples

sclérose.21Tableau 2Optimisation des agonistes de thiazolo [5,4-b] pyridineLa différence de puissance de S1P1 est plus de 10 fois supérieure

entre 5d et les deux la gem-dimethyl

analogue 5c et des-aza cyclopropane

analogue 6 (tableau 2) suggère

que la présence de cyclopropane et de pyridine confère à 5d soit une conformation unique soit des interactions uniques avec le

S1P1, ou les deux. Pour mieux comprendre le conformationnel

préférences de 5c, 5d et 6, les calculs de mécanique quantique22 étaient

effectuée sur des fragments correspondant à 5c, 5d et 6 (Figure 2, A, B, et

C, respectivement) pour caractériser le profil d’énergie de rotation à propos de

les liaisons NCCC ou CCCC indiquées. Les profils du fragment gem-diméthyl A et du fragment cyclopropyle B montrent des différences frappantes. Fragment A expositions

un profil assez peu profond et des minima globaux à 120 et 240 ° angles,

alors que B présente un profil abrupt favorisant grandement

180 ° angle dièdre. Le fragment de des-aza C ne partage pas le profil de B; plutôt, un

légère préférence pour un 0 ° l’angle dièdre est observé. c’était

en outre établi que, comme B, le fragment simple

La 2- (1-phénylcyclopropyl) pyridine montre également une forte préférence pour

un 180 ° Angle dièdre NCCC (données non montrées, voir Information de support). Le profil conformationnel unique

de 2- (1-phénylcyclopropyl) pyridines a, à notre connaissance,

pas été décrit précédemment. Il se peut que le complexe 5d-S1P1 soit propice à une internalisation efficace des récepteurs

contient 5d avec un 180 ° Angle dièdre NCCC et,

par conséquent, profite entropically de préorganisation de ligand.Figure 2Rotational

profil énergétique des fragments A (bleu), B (noir),

et C (rouge) correspondant à 5c, 5d et 6, respectivement (B3LYP / 6-31G * avec polarisable

Continuum Model pour simuler des milieux aqueux). Minimisation du fragment A à 0 ° Le dièdre NCCC était … La remarquable puissance in vitro de 5d traduite en

activité in vivo à des doses supérieures à un ordre de grandeur

inférieur à ce qui avait été précédemment réalisé dans notre programme (Figure ​ (Figure3a) .3a). Dosé par voie orale à 0,01, 0,03 et 0,1 mg / kg à

Rats Lewis, 5d a produit une réduction dose-dépendante

numération lymphocytaire sanguine circulante compatible avec l’agonisme S1P12 24 h après l’administration23.

signification (P < 0,05) a été atteint au 0,03

mg / kg (réduction de 45% des lymphocytes par rapport au véhicule) et doses de 0,1 mg / kg

(65% de réduction des lymphocytes vs véhicule). Depuis agonistes S1P1

produisent typiquement une réduction maximale de 70% du nombre de lymphocytes 24, la dose de 0,1 mg / kg

le rat fournit un effet pharmacologique presque maximal.25 Le composé 5d a été profilé chez un rat

modèle expérimental d’encéphalomyélite auto-immune (EAE) qui a des caractéristiques

de la maladie humaine la sclérose en plaques (Figure 33b) (Figure 33b) .26 Dans ce modèle EAE, les rats Lewis sont

immunisé avec la protéine basique de myéline de cobaye et marqué quotidiennement sur

une échelle de 0 − 6 reflétant le degré d’incapacité observé (0

= aucun signe d’incapacité), l’investigateur évaluant le

score aveugle au groupe d’étude des rats individuels. Le début

de la maladie se produit généralement 10 jours postimmunization, avec complet

résolution de la maladie à 20 jours de post-immunisation. 5d par voie orale une fois par jour à 20 μ g par jour (environ 0,1

mg / kg) au moment de la vaccination a entraîné un retard et une

réduction du score de la maladie (Figure ​ (Figure3) .3). Un 10 fois

dose plus faible de 5d (2 μ g, environ 0,01 mg / kg)

n’a pas significativement impacté le score de la maladie dans ce modèle.Figure 3In vivo

caractérisation de 5d. (a) 5d par voie orale

réduit le nombre de lymphocytes sanguins chez les rats Lewis femelles 24 heures après l’administration

(N = 5 / groupe; les barres représentent le lymphocyte sanguin moyen

compte + SE; les cercles représentent la concentration plasmatique moyenne ±

SE; * P < ... Profilage supplémentaire établi que 5d possède

caractéristiques acceptables pour un développement ultérieur. Chez le rat, non humain

primate, et le chien (tableau 3), le composé avait

faible clairance (4 − 21% du débit sanguin hépatique), un équilibre modéré

indiquer le volume de distribution du médicament total (Vss = 1,2 − 2,3 L / kg), une résidence moyenne à modérée

temps (5 − 17 h), et biodisponibilité orale acceptable (34 − 64%).

Des études sur la sécurité cardiovasculaire chez des rats télémétriques ont établi un effet

niveau de fréquence cardiaque et changements de pression artérielle moyenne de 10 mg / kg

(po), indiquant une large marge pour S1P3 associée cardiovasculaire

toxicité. Des études in vitro ont établi que 5d n’était pas

un inhibiteur ou un inducteur des enzymes du cytochrome P450 humain, était non mutagène

(Ames et micronucleus négatif), et n’a pas inhibé de manière significative

le canal hERG dans un test d’électrophysiologie à la concentration la plus élevée

testé (2.3 μ M) .27Tableau 3Pharmacokinetic Paramètres pour 5dLa synthèse de 5d est détaillée dans le schéma 1. Bromure d’aryle 7, synthétisé dans un

pas du 4-bromo-3-fluorobenzaldéhyde facilement disponible,

traité avec n-BuLi pour effectuer un échange lithium-halogène,

et on a laissé l’anion résultant réagir avec la 2,6-dichloro-3-isothiocyanatopyridine

pour donner un thioamide intermédiaire. Traitement du thioamide avec

le carbonate de sodium dans le DMF à la température élevée a effectué la cyclisation

à la thiazolo [5,4-b] pyridine 8. A

Réaction de Suzuki entre l’acide 8 et 1-phénylvinylboronique

catalysée par PdCl2 {PtBu2-p-NMe2-Ph} 228 fourni 9. Le cyclopropane était

installé avec du méthylure de diméthyloxosulfonium sous Corey − Chaykovsky

conditions29 pour donner 10, et

déprotection de l’acétal a révélé l’aldéhyde 11. réductrice

amination de 11 avec du chlorhydrate de méthyl azétidine-3-carboxylate

fourni l’avant-dernier intermédiaire 12. Saponification

de 12 accordé 5d, qui a été isolé dans

En conclusion, une série thiazolopyridine d’agonistes S1P1

a été développé dans le but de réduire la lipophilie et d’augmenter

la surface topologique polaire d’une série de benzothiazole existante.

La puissance modérée de la thiazolo [5,4-b] pyridine

série a été améliorée par l’ajout de petits groupes lipophiles à la

position benzylique. Le dérivé contenant le cyclopropyle 5d avait des propriétés physicochimiques calculées améliorées, exhibées à un chiffre

nanomolaire S1P1 puissance avec sélectivité contre S1P2, S1P3 et S1P4, et était capable de

réduire la numération lymphocytaire et la sévérité des

encéphalomyélite auto-immune chez le rat à la dose de 0,1 mg / kg. Moléculaire

les expériences de modélisation ont révélé une préférence non anticipée du fragment 5- (1-phénylcyclopropyl) thiazolo [5,4-b] pyridine pour un rotamère avec un dièdre NCCC

angle de 180 &#x000b0 ;, ce qui différencie 5d des connexes

analogues moins puissants. Expériences in vitro et in vivo supplémentaires

établi que 5d possède des propriétés acceptables pour

développement ultérieur.