Synthèse et évaluation de 2,6 -Modified Purine 2 ′ -C-méthyl ribonucléosides en tant qu’inhibiteurs de la réplication du VHC

Hépatite C

virus (VHC) est un problème de santé global qui affecte environ 170 personnes

millions de personnes dans le monde, et c’est une cause majeure de foie

cirrhose et carcinome hépatocellulaire.1,2 Plusieurs curatives

les options sont maintenant disponibles pour les infections à VHC, mais ils exigent tous

au moins deux agents antiviraux à action directe pour obtenir des taux de guérison

de 90 à 100%. Les inhibiteurs nucléosidiques de la polymérase NS5B du VHC sont favorisés

car ils ont généralement une barrière génétique élevée à la résistance aux médicaments

et sont une activité pan-génotypique.3 Sofosbuvir

(PSI / GS-7977) 1,4 a 2 ′ -deoxy-2 ′ – α -fluoro-2 ′ – β -C-méthyl-nucléoside monophosphate promédicament, a été approuvé

par la FDA en décembre 2013 en tant qu’agent anti-VHC sûr et efficace

(Figure ​ figure 11) .5 IDX-184 2 et BMS-986094 (INX-189) 3, deux promédicaments nucléosidiques apparentés, leurs précurseurs

actif 2 ′ – β -C-méthylguanosine triphosphate,

a également montré une puissance élevée in vitro et des résultats prometteurs

au début des études cliniques, mais leur développement a été terminé après

faible efficacité chez les humains pour IDX-184 et effets cardiaques sévères

observé lors d’une étude de phase 2b avec BMS-986094. Basé sur le potentiel

de ces 2 ′ -C-méthyl nucléosides, nous présentons,

La présente invention concerne la synthèse de nouvelles purines 2, 6-méthyl-ribonucléosides modifiées en position 2,6 qui peuvent offrir des alternatives potentielles.

à BMS-986094 et IDX-184 ou peut-être utilisé en combinaison avec Sofosbuvir.Figure 1Sélectionné

analogues nucléosidiques anti-HCV cliniques. Dans la conception des modifications de 6 positions, nous nous sommes efforcés de

maintenir les groupes qui ont conservé les caractéristiques d’acceptation des liaisons hydrogène

tel qu’il est présent dans la position 6 de la guanosine naturelle. La clé de la

synthèse de 2-amino, 6-modifié 2 ′ -C-méthyle

nucléosides était intermédiaire 5 qui a été préparé par connu

méthodes.6 Ciblées 6-N3 et

Purines 6-NH-O-substituées 10 – 12 étaient

facilement préparé à partir de nucléoside 6 débenzoylé par réaction

avec NaN3, la méthoxyamine et l’hydroxylamine (Schéma 1). Fait intéressant, les tentatives

pour préparer le composé 6-ONH2 9 à partir de N-Boc-hydroxylamino et de N- (benzyloxycarbonyl) hydroxylamino

dérivés 7 et 8 ont échoué en tant que

toutes les tentatives de déprotection des intermédiaires 7 et 8, en utilisant l’acidité (composé 7) ou un métal de transition catalysé

hydrogénation (composé 8), conduit exclusivement à la formation

de 2 ′ -C-méthylguanosine.Scheme 1Réactifs et conditions: (a) 2-amino-6-chloropurine, DBU, TMSOTf,

− 40 à 80 ° C, 5 h, 92%; (b) assis. NH3 / MeOH,

rt, pendant la nuit, 90%; (c) pour 7, HONHBoc, NaH, THF, rt,

3 h, 69%; pour 8, HONHCbz, NaH, THF, rt, 3 h, 88%; (ré)

pour 7, 80% TFA, H … Autre, plus rare

des fonctionnalités telles qu’un phosphonate et un groupe éthoxyvinyle étaient

également introduit à la position 6 (Schéma 2). Ainsi, le dérivé 6-diéthylphosphonate 15 a été préparé par réaction du nucleoside 6-chloropurine 5 avec du phosphite de triéthyle (schéma 2) à 130 ° C et déprotection subséquente.

dans une solution saturée d’ammoniaque dans l’éthanol. Le composé 5 a également été mis à réagir avec TMSI pour générer l’intermédiaire iodo 13 plus réactif, qui a été couplé avec du tributyl (1-éthoxyvinyl) stannane.

dans des conditions de couplage de Stille catalysées par du palladium. Déprotection finale

en utilisant une quantité catalytique de méthylate de sodium dans du méthanol

composé final 14.Schéma 2Réactifs et conditions:

(a) P (OEt) 3, 130 ° C, pendant la nuit, 78%; (b) assis. NH3 / EtOH, poids moléculaire, 4 d, 44%; (c) TMSI, CH2C12, température ambiante, 9 heures, 63%; (d) tributyl (1-éthoxyvinyl) stannane, Pd (PhP3) 2Cl2, THF, 80 ° C, 24 h, 54%; (e)

Chat. NaOMe, CH3OH, rt, 12 h, … Sachant que la position 2 de l’adénosine n’est pas impliquée

dans la liaison hydrogène de l’appariement des bases tandis que le groupe 2-amino de

guanosine est, nous avons ensuite tourné notre attention sur la synthèse de 2-modifié

les nucléosides puriques. 2-Hydroxylamino-, 2-fluoro-, 2-méthoxy- et 2-azido-purine

les nucléosides ont été ciblés car ils offrent potentiellement une variété de stérique,

interactions électroniques et de liaison hydrogène, ce qui peut améliorer la reconnaissance

par la polymérase NS5B du VHC dans leurs formes 5-triphosphate. La clé

2,6-dichloropurine-2 ′ -Me nucléoside 16 a été préparé d’une manière similaire à 6 (schéma 1) avec 2,6-dichloropurine,

TMSOTf et DBU. Le traitement du nucléoside 2,6-dichloropurine 16 avec une solution saturée d’ammoniac dans le méthanol conduit à

formation concomitante d’un composé 6-amino 17 et 6-méthoxy

composé 18 (Schéma 3). Cette réaction a été préformée à température ambiante

pour éviter le déplacement du groupe 2-chloro et semblait aller de l’avant

principalement par la première formation du composé 6-méthoxy, qui

est ensuite converti en 6-amino via le déplacement de l’ammoniac. Le benzoyle

la déprotection de groupe s’est produite assez rapidement et a été suivie par une lente

conversion partielle du 6-méthoxy nucléoside 18 en

le nucleoside 6-amino 17 au cours de la réaction de trois jours.

Avec 17 et 18 en main, notre objectif initial

était de préparer les dérivés 2-O-NH2 correspondants. Tandis que

la réaction de 17 et 18 avec N-Cbz hydroxylamine a bien fonctionné, le palladium catalysé par la suite

l’hydrogénation du groupe CBz n’a généré que des produits 2-hydroxy purine 22 et 25. Cependant, le dérivé 2,6-diméthoxypurine 23 et 6-amino-2-méthoxy purine 26 a été synthétisé avec succès par simple traitement des composés 16 et 17 avec du méthylate de sodium. La 2-azidopurine 20 a été préparée en deux étapes par la réaction de 2-chloro purine

dérivé 17 à l’hydrate d’hydrazine suivi d’un traitement

du composé hydrazine résultant 19 avec du nitrite de sodium

dans l’acide acétique.7,8 Comme prévu, 1H RMN

a montré que le composé 20 existe en tant qu’équilibre d’azido

(20a) et 1-N-tétrazole (20b) formes tautomères.9 − 11 Il est à noter qu’une séquence en deux étapes a été utilisée

parce que le traitement direct de 17 avec NaN3 a échoué

pour fournir le 2-azido nucleoside 20.Schema 3Réactifs et conditions: (a) 2,6-dichloropurine, DBU, TMSOTf, − 40

à 80 ° C, 4 h, 80%; (b) assis. NH3 / MeOH, température ambiante, 3 jours;

pour 17, 46%; pour 18, 21%; (c) K2C03, MeOH, température ambiante, 24 heures, 87%; (d) pour 24, HONHCbz,

NaH, THF, 50 ° C, 24 h, 81%; pour … couplage de type Vorbruggen entre le sucre tétrabenzoylé 4 et la 2-fluoro-6-aminopurine en présence de TMSOTf et

DBU a donné le composé 27 dans 80% (Schéma 3). Déprotection des trois groupes benzyles

l’utilisation d’une solution saturée d’ammoniac dans le méthanol a donné accès à la 2-fluoro-6-aminopurine

nucléoside 28, qui a ensuite été traité avec de l’O-méthylhydroxylamine pour donner le dérivé de 2-N-méthoxylamine purine désiré. 29.Il a été

maintenant bien établi que les analogues de nucléosides sont souvent incapables

être métabolisé par voie intracellulaire en son nucléoside correspondant

les triphosphates. Par conséquent, afin de surmonter le souvent limitant

première étape de phosphorylation et améliorer l’activité antivirale de notre

analogues nucléosidiques, nous avons préparé leur monophosphate correspondant

Promédicaments de type McGuigan.12 La synthèse

de phosphoramidates 31 – 46 a été réalisée

suivant la procédure d’Uchiyama en faisant réagir les nucléosides 10 – 12, 14, 15, 17, 18, 20, 22, 23, 25, 26, 28 et 29 avec le chlorophosphoramidate 30 (13) en présence de N-méthylimidazole

(Schéma 4) .14,15 Il est à noter que l’utilisation de l’acétonitrile comme co-solvant a été améliorée

la solubilité de certains nucléosides conduisant à de meilleurs rendements globaux.

Tentatives de préparation des promédicaments de nucleosides de 2-aminooxypurine par Cbz

l’élimination des composés 38 et 40 ne sont pas

réussi et a donné à la place les dérivés d’isoguanosine 39 et 41.Schéma 4Réactifs et conditions:

(a) NMI, THF / CH3CN, rt, 2 &#x02013, 3 h; (b) Pd / C, H2, MeOH, 15 h. Les nucléosides et le phosphoramidate

promédicaments ont été évalués pour l’inhibition de la réplication de l’ARN du VHC dans Huh7

cellules en utilisant un système de réplicon de HCV subgenomic.16 La cytotoxicité dans les cellules Huh7 a été déterminée simultanément avec anti-HCV

activité par extraction et amplification de l’ARN du VHC et du

ARNr (ARNr) .17 En plus de la cytotoxicité

a été déterminée dans le sang périphérique mononucléaire primaire humain (PBM)

cellules souches, cellules CEM lymphoblastoïdes humaines et cellules Vero vert africaines

(Tableau 1) .18,19 Dans un ensemble initial de composés, des modifications 6 inhabituelles telles que

l’introduction d’un ester phosphonate ou d’un groupe éthoxyvinyle

contre-productif et conduire à des nucléosides inactifs et monophosphate

les prodrogues 14, 15, 34 et 35. De même, les dérivés de purine 25 (2,6-diMeO), 22 (2-OH, 6-NH2), 23 (2-OH, 6-MeO),

et 29 (2-NHOMe, 6-NH2) et leurs correspondants

promédicaments phosphoramidate 39, 41, 46 et 42 ont montré être inactifs contre le VHC jusqu’à 10

μ M. En revanche, les dérivés de purines 6-substitués 7 (− ONHBoc), 8 (− ONHCbz) et 11 (− NHOH) ont présenté des valeurs EC50 contre le VHC de 0,9,

2,4 et 0,3 μ M, respectivement, sans toxicité apparente

à 10 μ M dans les cellules Huh7 et jusqu’à 100 μ M dans le PBM humain,

CEM, et les cellules Vero. Préparation de 31, le phosphoramidate

promédicament du composé substitué 6-NHBoc 7, même diminué

l’EC90 de 7 par un facteur de 10 (8,4

à 0,9 μ M pour 7). Cependant, il a été bien établi

que les nucléosides 6-modifiés peuvent être des substrats de désaminases 20 et, par conséquent, nous avons étudié le devenir de ces composés

intracellulaire. Ainsi, le composé 7 et son promédicament 31 ont été incubés dans des cellules Huh7 à 50 ° C pendant 4 h à

37 ° C. Les cellules ont été lavées avec une solution saline tamponnée au phosphate et

les métabolites intracellulaires ont été extraits avec 70% de méthanol glacé

dans l’eau et identifié par LC – MS / MS. Dans ce cas particulier,

le seul métabolite de NTP observé in vitro était un inhibiteur connu, le 2-méthylguanosine-5 ′ -triphosphate.

de la polymérase HC5 NS5B.

les composés 10 (2-NH2 6-NHOMe), 12 (2-NH2, 6-N3), 17 (2-Cl, 6-NH2), 18 (2-Cl, 6-OMe), 24 (2-ONHCbz,

6-NH2), 26 (2-OMe, 6-NH2), 21 (2-ONHCBz, 6-OMe), 20 (2-N3, 6-NH2), et 28 (2-F, 6-NH2) ne pas montrer

toute activité contre le VHC dans le système de réplicon lorsqu’il est testé jusqu’à

10 μ M, alors que leurs promédicaments phosphoramidate correspondants 32, 33, 36, 37, 38, 45, 40, 44 et 43 ont révélé leur puissance et ont montré des concentrations efficaces médianes

(CE50) entre 0,3 et 6,3 μ M (Tableau 1). Comme avec les composés 7 et 31, une étude de pharmacologie cellulaire de certains des plus puissants

inhibiteurs 45 (2-OMe, 6-NH2, 1 μ M), 44 (2-N3, 6-NH2, 2,3 μ M), et 43 (2-F, 6-NH2, 2,7 μ M) a été entrepris et

niveaux intracellulaires de nucléoside-MP, -DP et -TP formés dans Huh7

les cellules ont été quantifiées. Tous les dérivés de phosphoramidate 45, 44 et 43 ont produit des taux élevés de

NTP correspondant avec des quantités considérables de dérivés NMP et NDP.

Aucun autre NTP n’a été observé, ce qui implique que 45, 44 et 43 PNT sont responsables de l’anti-VHC

activité observée dans le système de réplicon et modification à 2 positions

de purines, contrairement à 6-modification, sont assez stables in vitro.En tant que première étape vers la compréhension de la différence de antiviral

activité observée entre le nucléoside 28 inactif et

son promédicament phosphoramidate 43 (EC50 = 2,7

μ M), une étude pharmacologique comparative dans les cellules Huh7 utilisant le

LC – La méthode MS / MS décrite ci-dessus a été réalisée. Alors que les deux composés

ont été trouvés pour livrer 28-TP, prodrogue 43 produit

∼ 20 fois plus de 5 ′ -triphosphate que 28.

Cet écart est directement lié à l’activité anti-VHC de

ces deux composés. Fait intéressant, nous avons également noté que les niveaux de métabolites

produits par 23 étaient très faibles dans les cellules Huh7, même pour

le nucléoside lui-même. Cela semble impliquer que non seulement le

le promédicament monophosphate 43 contourne la première phosphorylation

étape, mais il permet également une meilleure pénétration intracellulaire de

Pour caractériser davantage le composé 43, nous avons décidé d’étudier l’incorporation in vitro

de 28-TP (métabolite actif du phosphoramidate 43) par la polymérase NS5B du VHC (voir la figure 2 dans la section Informations de soutien). Synthèse d’ARN

par la polymérase NS5B du VHC a été surveillée en présence de

concentrations de 28-TP jusqu’à 100 μ M. Incorporation

de 28-TP a été marquée par l’apparition de sites en pause

résidus d’uridine opposés aux positions +11, +13 et +15 du 20mère

Modèle d’ARN, confirmant que le 28-TP se comporte comme un analogue A.

Enfin, comme prévu, l’incorporation accrue de 28-TP

corrélé avec l’inhibition de la formation de produit d’ARN 20mer sur toute la longueur

(Ki = 32 ± 0,07 μ M). Finalement,

puisque les effets hors cible peuvent être un problème avec les analogues nucléosidiques,

nous avons évalué la sélectivité de notre composé en testant 28-TP contre l’ARN polymérase II de l’hôte et l’ARN polymérase mitochondriale humaine

(POLRMT). À des concentrations allant jusqu’à 100 μ M, 28-TP

n’inhibe pas l’ARN polymérase II de l’hôte (tandis que α -amanitine, utilisé

comme contrôle positif, avait une CI50 de 2,5 ± 1,7 nM)

et n’a pas été significativement incorporé par POLRMT (incorporation de 11%

normalisée à l’ATP) .21Table 1In activité anti-HCV et cytotoxicité des nucléosides

et Phosphoramidate ProdrugsaMalgré le fait que les modifications de base ne sont souvent pas acceptées

par les polymérases et peut conduire à une toxicité indésirable, nous avons identifié plusieurs

substitutions à la base purique qui permettent à leur NTP d’être reconnu

par la polymérase du VHC. Ainsi, nous avons découvert les phosphoramidates 32, 33, 36, 37, 38, 45, 40, 44 et 43, qui affichaient des valeurs de CE50 dans la plage micromolaire inférieure

contre le VHC sans toxicité apparente chez Huh7, PBM, CEM et Vero

cellules jusqu’à 100 μ M. Le phosphoramidate 43 (2-F, 6-NH2), l’un des composés les plus puissants, a été davantage caractérisé.

Fait intéressant, nous avons constaté que 43, contrairement à son correspondant

nucléoside 28, produit des niveaux élevés de 28-TP dans les cellules Huh7. Le 28-TP a été montré pour être un substrat

de la polymérase NS5B du VHC et a été incorporé comme analogue de l’adénosine.

Profilage préclinique supplémentaire du composé 43 et exploration

de sa partie de promédicament est en cours. Nous envisageons donc de comparer

ce composé ou un promédicament apparenté au Sofosbuvir, INX-189 et IDX-184

dans différents dosages cellulaires et animaux et évaluer le potentiel

bénéfice thérapeutique d’une telle modification en 2 positions dans les nucléosides puriques

et nucléotides.