Stereochemical Survey of Digitoxin Monosaccharides

Digitoxin (Figure1,1, 1), un glycoside cardiaque trouvé dans Digitalis purpurea, a été bien étudié et utilisé au cours des siècles et est encore utilisé aujourd’hui Pour traiter l’insuffisance cardiaque congestive par l’inhibition de la membrane plasmique Na + / K + ATPase.1 La concentration intracellulaire de Na + accumulée à partir de cette inhibition entraîne une augmentation de la concentration en Ca 2+, ce qui augmente la contractilité cellulaire myocardique. Stenkvist a constaté que les patients atteints de cancer du sein sur digitale (digitoxine 1, digoxine 1a) avaient de meilleurs résultats que les patients non traités.2 Ils ont également constaté un taux de récidive 9,6 fois plus faible chez les patients digitaliques après mastectomie3. La digoxine (1a) est plus souvent prescrite en tant que médicament cardiaque que la digitoxine (1), alors que les propriétés pharmacocinétiques toxine un meilleur candidat pour la thérapie du cancer.Figure 1Digitoxine 1 et analogues glucidiques connexes.While aucun mécanisme détaillé de la mort des cellules tumorales a été démontré, de nombreuses voies de signalisation de l’apoptose ont été trouvés par la digitoxine4. Par exemple, la digitoxine a été démontrée in vitro On sait que l’inhibition de la Na + / K + ATPase active la tyrosine kinase Src, la phosphoinositide-3 kinase (PI3K) et le complexe de la phospholipase C du signalosome, ce qui peut induire de nombreuses formes d’apoptose et inhiber la croissance des cellules cancéreuses. Comme les effets anticancéreux de la digitoxine sont inférieurs à sa concentration cardiotoxique, de nombreuses voies indépendantes de la Na + / K + ATPase ont également été suggérées. 8 (aglycone / pharmacore) et le fragment trisaccharide, qui est connu pour jouer un rôle crucial dans l’inhibition de la croissance cellulaire et la mort des cellules tumorales.11 Plusieurs groupes de recherche ont étudié la structure et la relation d’activité (DAS) de la fraction glucidique de la digitoxine, bien qu’aucune étude systématique de la stéréochimie n’ait été effectuée. &#X02212 À ce jour, l’étude SAR la plus importante de la portion glucidique de la digitoxine sur les cellules cancéreuses est celle de Thorson15. Thorson a démontré la potentialité de renforcer l’activité anticancéreuse de la digitoxine en criblant une banque de monosaccharides de liaison MeON-neoglycoside à la digitoxigénine16. une conclusion limitée en matière de recherche et de sauvetage pourrait être faite pour conclure qu’un alcool axé sur C2S dans le sucre d était essentiel pour la cytotoxicité dans de nombreuses lignées cellulaires cancéreuses humaines. De manière importante, ils ont également noté que ces substrats étaient inactifs vis-à-vis de l’inhibition de la Na + / K + ATPase dans les lignées cellulaires de rein embryonnaire humain (HEK-293) et mammalien (CHO-K). Dans une comparaison directe entre la digitoxine MeON-neoglycoside et l’O-glycoside naturel contre une gamme de lignées cellulaires cancéreuses, notre étude récente a montré que la digitoxine O-glycoside est plus puissante que le MeON-neoglycoside dans l’activité de l’apoptose et des caspases.17 Cette étude montre la viabilité de la digitoxine avec le C2-D-sucre comme agent cytotoxique. En outre, nous avons démontré que la cytotoxicité dépendait de la longueur de la chaîne de sucre avec le monosaccharide 3 de digitoxine montrant une activité au moins 10 fois plus puissante que le disaccharide 2 et le trisaccharide 1 (digitoxine) contre une gamme de lignées cellulaires cancéreuses. pour la découverte de médicaments analogues à la digitoxine, elle a été limitée dans sa recherche de la stéréochimie (par exemple, l’anomère principalement sans C2 +) .16 Ainsi, nous avons décidé de tester d’autres analogues des monosaccharides de la digitoxine pour mieux comprendre le rôle que la chimie des hydrates de carbone joue dans l’effet anticancéreux. Dans la présente étude, nous avons synthétisé une série d’analogues de monosaccharides de la digitoxine (Figure 1, 4 − 10), à la fois α – et β -anomer, via un très stéréo / glycosylation chimio-sélective catalysée par le palladium.18 Cette stratégie de remplacement de sucre de novo peut être essentiellement utilisée pour installer de façon systématique une large gamme de glucides sur des produits naturels d’une manière adaptable au DAS, en présentant la synthèse et l’étude d’une gamme. Les analogues ont été comparés au panel de 60 lignées cellulaires humaines du National Cancer Institute (NCI) avec une étude plus approfondie des effets apoptotiques de l’analogue le plus puissant.Récemment , nous avons eu du succès en utilisant notre approche asymétrique de novo pour l’introduction de sucres rares / non naturels dans des produits naturels biologiquement importants.19 & 21 Cette approche a un grand potentiel pour la synthèse systématique de ster ensembles d’hydrates de carbone diversement divers (α / β -d / l).La route commence par l’utilisation d’une glycosylation catalysée par le palladium pour installer l’une quelconque des quatre digitoxigénine-pyranones correspondantes (par exemple, α -l-14a à α -l-16a, β -l- 14b à β -l-16b, α -d-15a à α -d-17a et β -d-15b à β -d-17b) à partir d’un On a donné facilement les pyranones donatrices de glycosyle de n’importe quelle stéréochimie donnée par une séquence en trois étapes à partir de l’acylfurane 11 (Schéma 1). Les stéréocentres absolus ont été installés en toute sécurité par une réduction asymétrique fortement énantiosélective de Noyori pour obtenir les furanylalcools optiquement purs 12 et (ent) -12 avec une énantiosélectivité élevée (ee) 98,23. Un réarrangement oxydatif Achmatowicz et diastéréosélectif La protection par Boc donne les mélanges de diastéréoisomères résultants, qui ont été séparés par Chromatographie éclair pour donner un rendement modéré du diastéréoisomère pur et – x003b2; -d- et # x003b1; – / β -l-Boc-pyranones (15a / b et 14a / b) .24,25 Avec un ensemble complet de Boc-pyranones en main, nous avons utilisé notre glycosylation catalysée par Pd [2,5 mol% Pd2 (dba) 3CHCl3, 10% en moles de PPh3] pour convertir chaque bloc de construction de sucre 15a / b et 14a / b en les précurseurs de monosaccharide de digitoxine 16a / b et 17a / b désirés avec un excellent rendement et une stéréorétention au centre anomère. La fonctionnalité enone résultante a ensuite été définie pour une transformation ultérieure en postglycosylation en divers stéréochimie et fonctionnalités sans dépendance des groupes protecteurs. Ces efforts ont commencé avec la synthèse de α -d- / l-rhamnose et α -d- / Analogues de monosaccharide de l-amicétose digitoxine. La stéréochimie de sucres C4 et C4 désirée a été installée diastéréosélectivement par réduction de Luche (NaBH4 / CeCl3, 78 ° C) pour donner l’alcool allylique 5 et 8 en tant qu’isomère unique (Scheme). 2). Le résultat C2 ′ -C3 ′ l’oléfine a été facilement hydrolysée pour donner exclusivement du rhamnose 18 et 6 grâce à la dihydroxylation de Upjohn (OsO4 / NMO) avec un excellent rendement.26 En outre, cette fraction fonctionnelle de l’ène a été réduite dans un état de diimide facile pour générer α -d- / l- amicétose 4 et 7 sélectif. L’addition de NMM comme solvant semble améliorer le rendement global de cette réaction.27,28Schéma 2Synthèse de α -d- / l-Rhamnose 18 et 6 et α -d- / L-amicétose 4 et 7 Digitoxin AnaloguesNotre effort vers les sucres β -d / l a commencé à partir de notre synthèse de 3,29,30 précédemment rapportée, une réduction des digitoxines pyranones 17b et 16b sous réduction de Luche, suivie par Myers réarrangement réducteur (NBSH, PPh3 / DIAD, NMM, température de C à la température ambiante) et Upjohn dihydroxylation a donné exclusivement diol 3 et 9 avec un excellent rendement en trois étapes (Schéma 3) .31 L’axiale résultant C3 &#x02032 ; -alcool 9 a été inversé via la réaction de Mitsunobu (DIAD / PPh3, p-NO2PhCO2H) et ensuite hydrolysé avec K2CO3 pour générer l’analogue de β -l-olivose 10. Nous avons ensuite soumis nos huit nouveaux monosaccharides de digitoxine (3 − 10), avec digitoxin disaccharide 2 et trisaccharide 1 à NCI pour l’évaluation de l’effet inhibiteur de croissance vers 60 3Synthèse de β -d- / l-Digitoxose 3 et 9 et β -l-Olivose 10 Digitoxine AnaloguesPrésent, nous avons montré que 1, 2 et 3 possèdent une activité antitumorale puissante contre Nous avons constaté que presque toutes les lignées cellulaires réduisaient significativement la capacité de croissance lorsqu’elles étaient traitées avec des analogues de la digitoxine monosaccharide (3 − 10, GI50 ∼ 1 − 10 nM), qui a montré une activité au moins 5 fois plus grande que la digitoxine 1 et la digitoxine disaccharide 2 (GI50 ∼ 50 − 100 nM, figure ​ figure2) .2). En particulier, le monosaccharide 3 de la digitoxine et l’amylétose 7 ont montré une excellente sélectivité et inhibition de la croissance contre plusieurs lignées cellulaires cancéreuses, y compris la leucémie (MOLT-4), le carcinome pulmonaire humain (A459 / ATCC et NCI-H460), le carcinome du côlon (HCT-116), l’adénocarcinome de l’ovaire humain (OVACR-3/8), le carcinome de la prostate humain (DU-145) et les six lignées cellulaires d’adénocarcinome rénal humain. Fait intéressant, α -l-amicétose 7 (GI50 ∼ 12 nM à travers les 60 lignées cellulaires) semblait être un meilleur inhibiteur de la croissance des cellules tumorales d’un facteur de 10 que son diastéréoisomère d-sucre α -d-amicétose 4 (GI50 &#x0223c: 113 nM à travers les 60 lignées cellulaires). De même, nous avons également trouvé β -d-digitoxose 3 (GI50 ∼ 25 nM à travers les 60 lignées cellulaires) montrant une plus grande puissance que son diastéréoisomère L-sucre β -l-digitoxose 9 (GI50 > 50 nM à travers les 60 lignées cellulaires). En raison de l’instabilité de la liaison glycosidique lors du stockage à long terme, l’alcool allylique 5 n’a pas été testé. Nous avons cependant pu tester l’activité de son diastéréo-isomère l-sucre 8, bien que sa cytotoxicité diminuée puisse également être due au même problème d’instabilité.La valeur de GI50 pour α -l-rhamnose 6 était inférieure à la concentration minimale qui pouvait être déterminée avec précision. Sur la base de ces découvertes, nous avons décidé de tester plus avant les analogues de la digitoxine les plus actifs β -d-digitoxose 3, α -l-amicétose 7 et α -l-rhamnose 6 contre la cellule non-petite cellule de cancer du poumon humain (NCI-H460) pour étudier son mode d’action. Le choix de NCI-H460 était basé sur son activité intermédiaire (c.-à-d., Pas la lignée cellulaire la plus ou la moins sensible) pour être le modèle in vitro représentatif de notre étude SAR.Figure 2Carbohydrate survey of digitoxin monosaccharide analogues (1 à 5 et 7 à 10) contre les lignes de cellules du panneau NCI, où les valeurs pour 6 sont représentées par la ligne pointillée. La valeur GI50 réciproque est affichée pour plus de clarté. Nous avons précédemment montré que β -d-digitoxose 3 induit l’apoptose dans les lignées cellulaires SK-OV-3, NCI-H460, NCI / ADR-RES et HT-29, ce qui est compatible avec d’autres résultats pour la digitoxine5,11,17 Digitoxine initie l’apoptose via des voies intrinsèques et extrinsèques reconnues pour s’associer avec différents effecteurs en aval. Pour évaluer les propriétés pro-apoptotiques de nos nouveaux analogues de la digitoxine monosaccharide 3, -l-rhamnose 6 et α -l-amicétose 7, nous avons effectué un test de cytotoxicité avec la digitoxine 1 et l’aglycone comme contrôle. Ce test a été réalisé avec une exposition de 12 h de médicaments en concentration croissante (10 nM à 10 μ M). L’activité de l’apoptose a été différenciée par la coloration nucléaire de Hoechst 33342 et l’iodure de propidium pour marquer les cellules ayant une chromatine intensément condensée et / ou des noyaux fragmentés des cellules qui subissent une nécrose.Notre résultat a clairement montré que les analogues monosaccharides 3, 6 et 7 de la digitoxine la puissance que la digitoxine 1 dans une gamme de 10 − 500 nM (P < 0,001) d'une manière dose-dépendante (Figure ​ (Figure3A) .3A). Une analyse de régression non linéaire a montré que α -l-rhamnose 6 était au moins 7 fois plus actif (IC50 & 462 nM) que la digitoxine 1 (IC50 ∼ 357 nM). Fait intéressant, α -l-rhamnose 6 a également montré une meilleure cytotoxicité que α -l-amicétose 7 (IC50 ∼ 55,7 nM) et β -d-digitoxose 3 (IC50 ∼ 74,8 nM) dans une plage de 50 − 250 nM (P < 0,001). En outre, le α -l-amicétose 7 est relativement plus puissant que le β -d-digitoxose 3 à 50 nM (P < 0,01). L'aglycone digitoxigénine était presque inefficace (IC50 > 323 nM) contre les cellules NCI-H460 in vitro, ce qui était cohérent avec les résultats rapportés par Lopez-Lazaro.11Figure 3 (A) Concentration − courbe de réponse de l’apoptose- mort cellulaire totale médiée par les analogues de la digitoxine dans un traitement de 12 h. (B) Le pourcentage de mort cellulaire apoptotique a été comparé pour chaque composé à une concentration de 50 nM (ANOVA à un facteur; ***, P < 0,001). [...] Pour différencier davantage la cytotoxicité entre l'apoptose et la nécrose, les cellules NCI-H460 ont été traitées avec Hoechst et l'iodure de propidium. La dégradation cellulaire avec des noyaux condensés et fragmentés comme le montre la coloration de Hoechst en bleu indique une apoptose, tandis que les cellules nécrotiques apparaissent complètement rompues en rouge lorsqu'elles sont colorées avec de l'iodure de propidium. Nous avons trouvé pour l'analogue 6 de la digitoxine le plus puissant que le rapport de mort cellulaire apoptotique et nécrotique était de 80:20 à une concentration de 50 nM (Figure 3C) .3C). Il convient de noter que le rapport de l'apoptose et de la nécrose devient difficile à estimer à une concentration de dose élevée (> 500 nM) en raison du taux élevé de mortalité cellulaire. Cependant, dans la comparaison de la digitoxine et de ses analogues dans l’activité de l’apoptose à 50 nM, nous avons trouvé que α -l-rhamnose 6 (45,8%) présentait l’activité d’apoptose la plus élevée (P < ​ Figure3B) .3B). Le β -d-digitoxose 3 (28,8%) et α -l-amicétose 7 (33%) ont montré moins d'activité, mais les deux ont montré une meilleure induction de l'apoptose que la digitoxine 1 (8,4%) et la digitoxigénine (8,5%) Nous avons ensuite quantifié la viabilité des cellules NCI-H460 en mesurant l'activité mitochondriale par test colorimétrique MTT pour comparer l'inhibition de la croissance cellulaire de nos analogues de la digitoxine. Conformément à nos résultats sur l'apoptose, les analogues des monosaccharides de digitoxine 3, 6 et 7 ont tous montré une cytotoxicité significativement plus forte que la digitoxine 1 de manière dépendante du temps et de la dose (P &#x0003c: 0,001, Figure 4A, B). 4A, B). En particulier, nous avons trouvé que les analogues des monosaccharides de digitoxine 3, 6 et 7 présentaient une meilleure inhibition de la croissance que la digitoxine 1 dans une gamme de concentration faible (10 Ȣ 25 nM) pendant 48 h de traitement (P < # x200B; Figure4B) .4B). Spécifiquement, les deux α -l-rhamnose 6 (GI50 ∼ 2 nM) et α -l-amicétose 7 (GI50 ∼ 2,2 nM) ont montré un plus grand effet inhibiteur de croissance que &#x003b2 ; -d-digitoxose 3 (GI50 ∼ 3,8 nM) ainsi que la digitoxine 1 (GI50 ∼ 10,7 nM).Ces résultats concordent également avec la valeur GI50 de nos données NCI, où α -l-rhamnose 6 (GI50 est indéterminée), α -l-amicétose 7 (GI50 ∼ 3,8 nM), et β -d-digitoxose 3 (GI50 ∼ 4,5 nM) présentait une activité au moins trois fois supérieure à celle de la digitoxine 1 (GI50 ∼ 12,8 nM) dans les cellules NCI-H460.Figure 4 (A) expérience dépendante (50 nM). (B) Expérience dose-dépendante (48 h). Les deux données dépendantes du temps et de la dose ont été analysées par ANOVA à deux voies (N = 9, *, P < 0,05; ***, P < 0,001). En résumé, nous avons étudié notre digitoxine nouvellement synthétisée. analogues de monosaccharides, dans lesquels on note un changement d'activité structurelle distinct entre les sucres d et l dans leurs données d'inhibition de la croissance de NCI. Par exemple, ces données ont montré que α -l-amicétose 7 et β -d-digitoxose 3 avec une plus grande puissance que leurs énantiomères de sucre (à savoir, diastéréomère), & amp; x003b1; -d-amicétose 4 et β -l-digitoxose 9. Nous avons également trouvé que les fragments de sucre β -d-digitoxose 3, α -l-rhamnose 6 et α -l-amicétose 7 ont montré les plus prometteuses activité antinéoplasique. Nos deux tests d'apoptose et de viabilité cellulaire ont montré une activité accrue pour les analogues des monosaccharides de digitoxine 3, 6 et 7 par rapport à la digitoxine naturelle 1. Nos résultats suggèrent une tendance globale de l'activité avec α -l-rhamnose 6 ≥ α -l-amicétose 7 > β -d-digitoxose 3 > digitoxine 1 > digitoxigénine dans les effets d’induction de l’apoptose et d’antiprolifération dans les cellules NCI-H460. Il est intéressant de noter que la cytotoxicité des cellules cancéreuses pour les structures 6, 7 et 3 n’est pas incompatible avec la conclusion SAR de Fullerton pour l’activité cardiotonique des cardioglycosides32. Cette étude met en évidence notre méthode asymétrique de novo pour l’introduction unique de &#x003b1 ; / β -d / l stéréoisomères, qui peuvent être facilement établis via une glycosylation catalysée par le palladium couplée à une série de transformations post-glycosylation. Cette approche montre non seulement une préparation efficace de nouveaux analogues de la digitoxine, mais démontre également son utilisation pour des études SAR systématiques. De plus, cette comparaison des stéréoisomères des monosaccharides de la digitoxine donne un meilleur aperçu de l’effet de la fraction glucidique sur l’activité anticancéreuse pour la conception d’agents anticancéreux glycosidiques cardiaques potentiels. D’autres investigations sur cette ligne sont en cours et seront rapportées en temps voulu.