Propagation nosocomiale de la veine intégrée à l’intégrone – Comme la cassette codant pour une β-lactamase à spectre étendu chez Pseudomonas aeruginosa en Thaïlande

Le contenu du gène de la β-lactamase et l’épidémiologie des isolats de Pseudomonas aeruginosa résistants à la ceftazidime% du nombre total d’isolats de P aeruginosa ont été étudiés dans un hôpital universitaire en Thaïlande pendant une période d’un mois d’isolats cliniques non répétitifs, produisant un clavulanique de type VEB Ces isolats appartenaient à différents types et sous-types d’électrophorèse en champ pulsé. Dans le cas où le gène de type blaVEB était situé sur un plasmide, les gènes de type blaVEB étaient présents comme une cassette de gènes sur les intégrons de classe. dont la taille et la structure variaient Dans la plupart des cas, la cassette veb était associée à une résistance à la rifampicine, à des cassettes de gènes de résistance aux aminoglycosides et à une cassette de type oxa codant pour une β-lactamase de type oxacillinase à spectre étroit. indique que les ESBL peuvent être endémiques chez P aeruginosa et illustre que les intégrons sont des moyens efficaces pour leur propagation

Pseudomonas aeruginosa est un pathogène nosocomial commun, en particulier chez les patients immunodéprimés. Il présente une résistance intrinsèque à plusieurs β-lactamines et peut acquérir des mécanismes de résistance supplémentaires aux β-lactamines qui réduisent davantage sa sensibilité à ces médicaments. Chez P. aeruginosa, la résistance à la ceftazidime résulte principalement d’une La surexpression de ses β-lactamases à spectre étendu inhibées par l’acide clavulanique de type AmpC a été signalée pour la première fois dans un isolat de Klebsiella pneumoniae en Allemagne, suivie de nombreuses espèces entérobactériennes impliquées dans des épidémies . La résistance aux céphalosporines à spectre étendu, telles que le céfotaxime, la ceftazidime et le céfépime, et au monobactam aztréonam Depuis , les BLSE inhibées par l’acide clavulanique de classe A d’Ambler suivantes ont été rapportées chez P. aeruginosa: SHV-a, TEM-, TEM -, TEM-, PER- et VEB- Le gène blaVEB- a été signalé chez plusieurs isolats d’entérobactéries de l’Asie du Sud-Est et des isolats cliniques de P aeruginosa , toujours en tant qu’intégron localiséIntegrons contient un système de recombinaison spécifique au site capable de capturer et d’exprimer des gènes comme cassettes de gènes Les intégrons de classe sont principalement isolés des antibiotiques isolats gram-négatifs, contiennent des cassettes de gènes insérées entre des régions conservées Le «segment -conservé» -CS contient un gène d’intégrase, intI, qui code pour une recombinase spécifique d’un site; un site adjacent, attI, qui est reconnu par l’intégrase et agit comme un site récepteur pour les cassettes de gènes; et une région promotrice commune Pant P et / ou P, à partir de laquelle les cassettes de gènes intégrés sont cotranscrits Le « segment » -CS, situé en aval des cassettes de gènes intégrés, contient généralement des gènes, qacE qui confère une résistance antiseptique, sulI qui confère une résistance Les cassettes de gènes sont des unités mobiles discrètes composées d’un gène habituellement un gène de résistance aux antibiotiques et d’un site de recombinaison attC situé en aval du gène Bien que la plupart des gènes de type oxacillinase soient L’intégron situé , blaVEB-, avec un autre gène de la β-lactamase, blaGES-, sont les seuls gènes de classe A BLBL d’Ambler qui prennent la forme de cassettes de gènes dans les intégrons [,,] Le but de cette étude rétrospective était d’évaluer prévalence d’isolats nosocomiaux de P. aeruginosa résistants à la ceftazidime et, parmi eux, d’isolats producteurs de BLSE récupérés chez des patients hospitalisés dans un hôpital en Thaïlande pendant une période de 1 mois. Cette étude a montré que la dissémination des gènes de la β-lactamase de classe A localisée dans l’intégrone contribuait significativement à la résistance aux céphalosporines à spectre élargi dans les isolats cliniques de P aeruginosa.

Matériaux et méthodes

Les marqueurs de résistance à la ceftazidime en P aeruginosa PU résistant à la ciprofloxacine ou à la rifampine ou E coli JM résistant à la rifampicine ont été essayés en utilisant des dosages liquides et solides à ° C en atmosphère aérobie Les transconjugants ont été sélectionnés sur agar Trypticase soja TS Les plaques contenant de la ceftazidime μg / mL plus de la ciprofloxacine μg / mL ou de la rifampicine μg / mL de l’ADN plasmidique des isolats de P aeruginosa ont été extraites par plusieurs méthodes, comme décrit ailleurs , et utilisées pour transformer les cellules électrocompétentes E coli DHB. Biorad, qui a été sélectionné sur des plaques de gélose TS contenant de la ceftazidime μg / mL L’ADN plasmidique des transformants a été analysé comme décrit ailleurs Electophorèse en gel à champ pulsé L’analyse PFGE PFGE a été réalisée selon les instructions du fabricant Biorad En bref, l’ADN génomique a été digéré avec SpeI à ° C pendant une nuit L’électrophorèse à travers un gel d’agarose en% dans du tampon Tris-borate-EDTA a été réalisée en utilisant un CHEF DRI Les conditions de migration de l’appareil Biorad étaient les suivantes: température, ° C; tension, V / cm; angle de commutation, ° avec rampes linéaires de – s pour h et – s pour h supplémentaire Le gel coloré au bromure d’éthidium a été photographié sous éclairage ultraviolet L’échelle λ-ADN Biorad a été utilisée comme marqueur de poids moléculaire de l’ADN Les empreintes digitales chromosomiques comparé à l’oeil et assigné aux types et sous-types de PFGE Hybridisations Des hybridations ADN-ADN ont été réalisées comme décrit par Sambrook et al , avec un transfert Southern d’un gel d’agarose PFGE contenant de l’ADN de cellules entières de P aeruginosa La sonde était constituée d’un fragment PCR -bp généré à partir du plasmide recombinant pRLT- et interne à blaVEB- Le marquage de la sonde et la détection du signal ont été réalisés par un kit de marquage et de détection non radioactif selon les instructions du fabricant. Analyse IEF Des cultures d’isolats de P aeruginosa et de transformants de E coli ont été cultivées pendant une nuit à un ° C dans un bouillon TS-TS contenant du ceftazidime. μg / mL et extraits de β-lactamase obtenus comme décrit ailleurs L’analyse IEF a été réalisée en utilisant une gamme de pH de gel de polyacrylamide contenant de l’ampholine, – sur un appareil à plat FBE-; Amersham Pharmacia Biotech avec des valeurs pI de point isoélectrique β-lactamase connues comme standards L’activité β-lactamase a été détectée avec une solution de nitrocefin, comme décrit ailleurs Amplification PCR de gènes de β-lactamase, analyse d’intégrons de classe et séquençage ], une série d’amorces a été conçue pour la détection des gènes de la β-lactamase de classe A Ambler. La détection a été réalisée pour les gènes codant TEM TEM-A et TEM-B, SHV SHV-F et SHV-B, PER- / PER-PER-A et PER-B, VEB-VEB-A et VEB-B, CTX-M – comme CTXM-A et CTXM-B, TOHO- / TOHO-TOHO-A et TOHO-B, et GES-GES-A et GES En outre, comme les gènes de la carbénicillinase sont souvent présents dans P aeruginosa et que l’oxacillinase blaOXA- gène est associé à des intégrons contenant blaVEB , des amorces ont été utilisées pour Détection par PCR des gènes de type blaPSE CARB-A et CARB-B et des gènes de type blaOXA OPR- et OPR- Pour chaque réaction, μg d’ADN de cellules entières provenant du P a Des isolats eruginosa ou μg d’ADN plasmidique provenant de l’électroporant E coli DHB ont été utilisés. Les primers pour la détection des intégrons de classe se situaient dans les amorces ‘-CS et’CS des régions’ -CS et ‘-CS Une combinaison de’ -CS ou ‘-CS et blaVEB- amorces ont également été utilisés pour la détermination du contenu génétique des intégrons de classe’ -CS et VEB-INV ou ‘-CS et VEB-INV- En outre, parce que les arr-, aadA, aadB , et les gènes cmlA ont été trouvés dans les intégrons contenant des blaVEB séquencés dans Enterobacteriaceae , ainsi que les séquences d ‘insertion IS et IS dans l’ intégron In blaVEB de l ‘isolat P aeruginosa JES , les amplifications PCR ont été effectuées avec amorces s’hybridant aux extrémités de ces séquences nucléotidiques La position relative de chaque cassette génique et la séquence d’insertion ont ensuite été déduites par comparaison de la longueur des produits PCR obtenus avec ceux des intégrons contenant blaVEB séquencésPour le séquençage direct de l’ADN, amplifications PCR étaient p L’utilisation d’amorces permettant l’amplification de l’ensemble des amorces de la cassette du gène blaVEB- VEBcas-F et VEBcas-B Les produits de PCR ont été purifiés par purification PCR. colonnes Qiagen Les réactions de séquençage ont été réalisées en utilisant les mêmes amorces blaVEB spécifiques et des produits distincts d’amplification par PCR avec un séquenceur automatique ABI; Biosystèmes appliqués Les séquences de nucléotides et d’acides aminés déduits ont été analysées à l’aide d’un logiciel disponible sur Internet sur le site Web du Centre national de la biotechnologie http: // wwwcnbinlmnihgov La séquence nucléotidique du gène blaVEB- a été affectée à la base de données EMBL GenBank AY

Résultats

Epidémiologie et détection par PCR des gènes de la β-lactamase La résistance à la ceftazidime représentait% des isolats de P aeruginosa Trente-trois isolats de P. aeruginosa résistants à la ceftazidime non réplicats ont été retrouvés chez des patients hospitalisés dans un hôpital de Bangkok de juin à octobre. les unités pédiatriques, médicales, chirurgicales et de soins intensifs La plupart des isolats ont été récupérés chez des patients à risque d’infection à P. aeruginosa, tels que les brûlés, le diabète sucré et l’infection au VIH. Aucun de ces isolats n’a été retrouvé chez des patients atteints de pneumonie , pour qui P aeruginosa se présente généralement comme une cause primaire

Tableau View largeDownload slide Caractéristiques cliniques des isolats de P aeruginosa résistants à la ceftazidime blaVEB-PCR et source patientsTable View largeDownload slideClinical characteristics des isolats de P aeruginosa résistants à la ceftazidime blaVEB- PCR et des patients sourcesLes tests préliminaires de sensibilité aux antibiotiques par diffusion sur disque ont montré une synergie Les isolats ont donné des amplifications positives basées sur la PCR avec des amorces spécifiques de blaVEB. Aucun d’entre eux n’a été trouvé positif avec les amorces de PCR spécifiques à blaTEM, blaSHV, blaGES-, blaPER- et blaCTX-M- codant pour les β-lactamases à spectre étroit et étendu Tous les isolats, sauf les isolats, et, étaient blaOXA-PCR positifTransfer de résistance et analyse plasmidique Transfert par conjugaison d’un marqueur de résistance à la ceftazidime des isolats de P aeruginosa à P aeruginosa ou Les souches de référence d’E. Coli ont échoué Aucun ADN plasmidique n’a été détecté pour P aeruginosa clinique. oléates, à l’exception de P aeruginosa, pour lequel un plasmide ~-kb, nommé « pDLG-« , a été trouvé. Données non montrées Les extractions d’ADN plasmidique des isolats de P aeruginosa utilisés pour transformer les cellules E coli ont donné un E coli transformant uniquement avec l’extraction d’ADN plasmidique de Isolat de P aeruginosa Ce transformant était résistant à la ceftazidime et blaVEB-PCR positif aux antibiotiques β-lactamines et à l’IEF. Les isolats de P aeruginosa étaient résistants aux céphalosporines à spectre élargi et à l’aztréonam à des niveaux élevés et similaires L’addition d’acide clavulanique diminuait significativement les CMI du ceftazidime et CMI de l’aztréonam des β-lactamines pour le transformant E coli DHB de l’isolat de P aeruginosa étaient similaires à ceux obtenus pour les isolats entérobactériens exprimant VEB- [,,] Selon les résultats des tests de sensibilité à la diffusion, les souches cliniques étaient résistantes aux de nombreuses autres classes d’antibiotiques, y compris, dans la plupart des cas, la ciprofloxacine et la rifampicine à l’exception des souches,, et; table

Tableau View largeTéléchargement de glissementsMIC de β-lactamines pour des isolats cliniques de Pseudomonas aeruginosa blaVEB-PCR positif, un transformant DHB d’Escherichia coli qui héberge le plasmide naturel pDGL- provenant de l’isolat de P aeruginosa, et E coli DHB reference strainTable View largeTéléchargements de glicamériques de β-lactamines pour blaVEB – Des isolats cliniques de Pseudomonas aeruginosa positifs à la PCR, un transformant DHB Escherichia coli contenant le plasmide naturel pDGL- provenant de l’isolat de P aeruginosa et une analyse EIF coli DHB de référence ont montré que la plupart des isolats cliniques présentaient des activités β-lactamases avec des valeurs pi de,, et – la valeur de pI correspondant à des β-lactamases de type OXA des souches positives pour blaOXA-PCR, la valeur pi de correspond aux β-lactamases de type VEB, et la valeur pI de – correspond probablement au type AmpC Les céphalosporinases à codage chromosomique de P aeruginosa Dans les cas isolats,, et, seulement, les valeurs pI et trouvées conformes à leur amplification par PCR blaOXA – négative. Dans les cas isolés, on a trouvé une valeur pI supplémentaire correspondant aux gènes de type blaCARB, comme le montrent les résultats de PCR positifs. Dans l’isolat de cas, on n’a pas trouvé de pI, alors que l’isolat était blaOXA positif, qui peut s’expliquer par l ‘absence d’ une analyse et d ‘une hybridation de l’ enzymePFGE de type OXA Le profil PFGE de l ‘ADN restreint à SpeI des isolats cliniques de P aeruginosa a montré que le foyer de souches blaVEB – positives n’était pas causé par une seule souche. les profils PFGE des isolats cliniques donnaient les types PFGE principaux Chaque type ou sous-type de PFGE contenait les souches indiscernables ou clonales suivantes: isolats de type A,,,, et, isolats de type B,,, et, et isolats de type C,,,, , , , , , , , , , , , et ; Figure A Les autres souches isolent, et ne sont pas apparentées aux types PFGE Figure AA Le profil PFGE n’a pu être obtenu pour l’isolat, malgré des tentatives répétées Figure A Les isolats liés au clonage n’ont pas été identifiés chez les patients hospitalisés dans le même service Par exemple, isolats appartenant au type C ont été trouvés dans les unités pédiatrique, chirurgicale et de brûlure figure A; L’ADN contenu dans le gel de PFGE a été transféré sur une membrane de nylon et hybridé avec une sonde interne pour blaVEB- Seul un seul signal d’hybridation a été observé par souche B Ce résultat a montré que chaque isolat contenait seulement une copie du gène blaVEB- ou dans le cas de plusieurs copies, les plusieurs copies putatives seraient situées sur le même fragment SpeI. D’intérêt, les fragments hybridants étaient de tailles différentes, sauf pour les déformations,,,,,,,,,,,,,, et qui appartenaient au même type de PFGE, type C figure B

Figure View largeTéléchargement diapositive Electophorèse sur gel à champ pulsé Profils PFGE d’ADN à cellules entières digérées par SpeI des isolats A de Pseudomonas aeruginosa et transfert de Southern blot, suivi de leur hybridation avec une sonde interne pour les souches blaVEB-P aeruginosa -, B; Les profils de PFGE et les sous-types sont indiqués ci-dessous. Transfert de transfert de Southern, suivi de leur hybridation avec une sonde interne pour les souches blaVEB-P aeruginosa -, B; Les types de PFGE et les sous – types sont indiqués ci – dessous: identification des gènes de type blaVEB et détermination de la structure des intégrons à partir de l ‘ADN de cellules entières d’ isolats de blaVEB – positifs sélectionnés au hasard, , et, les amorces externes situées sur la cassette veb ont été utilisées pour l’amplification par PCR et, par la suite, pour séquencer l’ensemble des gènes de type blaVEB. Un gène blaVEB- identique a été identifié dans les cas isolats et un variant nommé blaVEB- les autres cas isolent et Le gène blaVEB- diffère de blaVEB- par une seule substitution nucléotidique A → G en position du gène La substitution d’acides aminés déduite était Thr → Ala en position située dans la séquence N-terminale de la protéine mature à côté du site de clivage du peptide leader En utilisant une série d ‘amorces, la structure des intégrons de classe blaVEB – positive a été déduite pour chaque isolat de P aeruginosa. Une corrélation a été établie entre le type PGFE et la structure des intégrons Dans un type PFGE type B, les souches,, et, différentes structures d’intégrons ont été trouvées La structure d’intégron la plus commune a été trouvée dans les souches appartenant aux types PFGE A et C localisation. de cassettes de gènes codant pour la β – lactamase de type VEB, ARR – qui confère la résistance à la rifampicine, CMLA – qui confère la résistance au chloramphénicol, β – lactamases de type OXA, ANT « – I aadB, et ANT ‘- IaadA;  » – Je confère une résistance à la dibékacine, la gentamicine, la kanamycine, la sisomicine et la tobramycine, et ANT’-I confère une résistance à la spectinomycine et à la streptomycine Ces mêmes cassettes de gènes ont été trouvées dans les intégrons de classe blaVEB des isolats E coli et Proteus mirabilis de Figure vietnamienne Une corrélation a été établie entre la résistance à la rifampicine des isolats et la présence du gène arr, selon les résultats de la PCR, à l’exception de l’isolat résistant à la rifampicine qui était résistance au chloramphenicol et détection par PCR du tableau du gène cmlA-; Comme on le trouve dans les intégrons contenant blaVEB identifiés dans des isolats de P aeruginosa de Thaïlande , les séquences d ‘insertion IS et / ou IS, lorsqu’elles ont été trouvées, ont été insérées en amont des gènes de type blaVEB.

Figure Vue grandDownload slide Représentation schématique des différents intégrons de classe contenant la cassette veb-gene Les régions codantes sont représentées par des cases, les flèches indiquent leur orientation de traduction et les noms des gènes sont indiqués au-dessus des cases. Le segment CS contient le gène intI , qui code pour l’intégrase, et le ‘-CS, trouvé en aval des cassettes de gènes insérées, comprend le gène qacE qui code un déterminant de résistance antiseptique Les lignes pointillées représentent des séquences nucléotidiques indéterminées Les structures d’intégrons sont dessinées proportionnellement à leur taille déduite. les intégrons sont montrés dans la partie droite de la figure Les nombres en exposant et les parenthèses sont des nombres de référence, et les nombres entre parenthèses sont les nombres d’isolats de P aeruginosa dans la présente étudeFigure Voir grandTéléchargement de diapositive Représentation chimique des différents intégrons de classe contenant la cassette veb régions de codage sont représentés comme des boîtes, l’arro ws indiquent leur orientation de traduction, et les noms des gènes sont indiqués au-dessus des cases Le segment CS contient le gène intI, qui code l’intégrase, et le ‘-CS, trouvé en aval des cassettes de gènes insérées, comprend le gène qacE, qui Encode un déterminant de résistance antiseptique Les lignes pointillées représentent des séquences nucléotidiques indéterminées Les structures d’intégrons sont dessinées proportionnellement à leur taille déduite L’origine des intégrons est montrée dans la partie droite de la figure Les nombres en exposant et les parenthèses sont des nombres de référence et les nombres entre parenthèses sont les nombre d’isolats de P aeruginosa dans la présente étude

Discussion

La prévalence des isolats de P aeruginosa résistants à la ceftazidime dans cette étude était de% d’isolats de P aeruginosa, ce qui est supérieur à la valeur rapportée pour les isolats nosocomiaux de P aeruginosa d’Amérique du Nord et d’Europe Cependant, elle correspondait au% prévalence de résistance à la ceftazidime bacilles gram négatif trouvés dans une étude récente en Thaïlande Il est similaire à la prévalence en% d’isolats de P aeruginosa résistants à la ceftazidime en Turquie, où P aeruginosa produisant des BLSE était un problème majeur Parmi les isolats résistants à la ceftazidime en Thaïlande , les gènes de type blaVEB étaient répandus: ils étaient présents en% des isolats de P aeruginosa résistants à la ceftazidime. Ce résultat implique que les P aeruginosa producteurs de VEB étaient endémiques dans cet hôpital en Thaïlande et représentaient le haut niveau de résistance à la ceftazidime. une étude sur la distribution de BLSE dans P aeruginosa, réalisée en Turquie , a rapporté que% d’isolats de P aeruginosa résistants à la ceftazidime possédaient des souches de type blaPER non-agrégées Dans notre étude, l’expression du VEB-BLSE était probablement le principal mécanisme de résistance à la ceftazidime, car l’ajout d’acide clavulanique diminuait constamment les CMI de la ceftazidime. L’analyse PFGE montrait que la propagation d’isolats de P aeruginosa contenant blaVEB n’était pas par un seul clone La forte prévalence des isolats de P aeruginosa résistants à la ceftazidime blaVEB est similaire à celle observée pour les isolats entérobactériens résistants à la ceftazidime analysés dans le même hôpital de Bangkok pendant la même période . Enterobacteriaceae et maintenant chez P. aeruginosa suggère que ce gène BLSE est très répandu chez plusieurs espèces gram-négatives en Asie du Sud-Est. Bien que le plasmide blaVEB-positif de l’isolat de P aeruginosa ne soit auto-transférable ni à P aeruginosa ni à E. coli, capable de se répliquer dans E. coli Ainsi, ce plasmide a une large gamme d’hôtes, comme on l’a trouvé pour le plasmide codant pour TEM- dans P aeruginosa , qui h contribue à la dissémination du gène blaVEB La caractérisation moléculaire des gènes de type blaVEB provenant de plusieurs isolats de P aeruginosa a montré une variabilité parmi les protéines codées de type VEB, comme cela a été récemment observé chez les isolats de P aeruginosa du Koweït VEB-a et VEB- b Dans la présente étude, le changement d’acide aminé trouvé dans VEB- ne modifie probablement pas le spectre d’hydrolyse de l’enzyme Un aspect intéressant de la présente étude est la présence d’une BLSE de classe A Ambler dans P aeruginosa dans des structures variables La variabilité des structures d’intégrons, en particulier dans les souches clonales, suggère soit l’excision soit l’addition de cassettes de gènes d’un ancêtre d’intégron ou la propagation d’intégrons structurellement apparentés mais différents. La veb-cassette était toujours en première position ou précédée d’éléments d’insertion Figures IS et IS Ces éléments, identifiés à partir des intégrons de P aeruginosa contenant blaVEB et non des isolats entérobactériens , peuvent fournir un promoteur fort pour l’expression de blaVEB- indépendamment du promoteur situé dans l’intégraseDans les intégrons contenant blaVEB de P aeruginosa, comme dans ceux d’Enterobacteriaceae, la cassette veb était souvent associée à une cassette arr, à une cassette oxa et à un aminoglycoside. cassettes de gènes de résistance Ceci indique en outre que le gène arr-codant une enzyme modificatrice de la rifampicine était très répandu du fait de sa localisation d’intégron. D’un point de vue clinique, un traitement avec des antibiotiques non-ß-lactam – cassette qui confère une résistance à la ceftazidime Enfin, il s’agit de la première étude des isolats de P aeruginosa qui détaille la localisation médiée par l’intégrone des gènes de résistance aux antibiotiques pendant une période de temps donnée et dans un lieu défini